배경: DNA 가이드로 넓힌 Cas12의 역할

DNA 기반 가이드인 슈도 가이드 DNA(ΨDNA)를 결합한 CRISPR–Cas12가 인간 세포에서 표적 RNA의 양을 줄였다. Nature Biotechnology에 실린 이번 연구에서는 RNA 직접 절단 없이 발현 억제가 나타났다. 기전 분석은 표적 RNA 결합에 따른 리보솜 정체와 세포 내 분해 경로의 관여 가능성을 뒷받침한다.

CRISPR 시스템은 보통 크리스퍼 RNA(crRNA)를 가이드로 사용한다. 연구팀은 RNA보다 합성과 보관이 용이한 DNA로 가이드를 만들 수 있는지 살폈다. RNA 표적 도구인 Cas13에서 나타날 수 있는 비표적 RNA 절단과 구별되는 방식으로 RNA를 조절할 수 있는지도 연구의 관심사였다.

핵심 발견: 직접 절단 없이 RNA 발현을 낮추다

연구팀은 표적과 상보적인 DNA 서열에 crRNA의 골격 구조를 역방향으로 모방한 3′ 핸들을 붙여 ΨDNA를 설계했다. AsCas12a와 Cas12i1은 이 가이드로 RNA를 인식했다. 시험관에서는 RNA 인식 후 단일가닥 DNA 리포터의 비특이적 절단이 활성화돼 검출 신호가 발생했다. RNA 자체의 직접 절단이나 비표적 RNA의 부차 절단은 관찰되지 않았다.

세포 내 발현 억제는 주로 AsCas12a로 평가했다. HEK293T 세포에 AsCas12a 발현 플라스미드와 ΨDNA를 함께 넣자 PPIA·RPL4·PCSK9의 메신저 RNA(mRNA)가 비표적 가이드 대조군보다 50–70% 감소했다. HeLa·HepG2·MCF-7 세포에서도 PPIA 억제 효과를 확인했다. AsCas12a를 미리 발현시킨 HEK293T 세포에서는 PPIA가 95%, RPL4가 80%, PCSK9·NRAS가 약 90% 줄었으나 SMARCA4는 약 60% 감소했다. 효율은 표적과 전달 조건에 따라 달랐다. 같은 선발현 시스템에서 네 전사체를 동시에 표적화했을 때 억제율은 70.7–81.9%였다.

기전 분석에서는 절단 활성을 없앤 AsCas12a도 유사한 억제 효과를 냈고, 리보솜 프로파일링에서는 표적 PPIA의 리보솜 점유가 증가했다. 내인성 RNA 분해 효소 RNase H1과 복합체의 공간적 근접성도 관찰됐다. 이러한 결과는 리보솜 정체에 따른 분해 등 여러 경로의 관여 가능성을 지지하지만, 각 경로의 인과적 기여까지 확정하지는 못했다.

mRNA 시퀀싱(mRNA-seq)에서 평가한 비표적 발현 변화는 PPIA·RPL4 실험에서 비교 효소 RfxCas13d보다 각각 17.7배, 6.3배 적었다. 다만 표적 억제 효율도 RfxCas13d보다 낮았다. 별도의 번역 효율 분석에서는 표적과 상동 전사체를 포함한 17개 전사체에 유의한 변화가 나타났다. 비표적 영향이 완전히 사라진 결과는 아니다.

의미와 전망: 복합 유전자 기능을 조사하는 도구

연구팀은 ΨDNA와 기존 crRNA를 함께 전달해 RNA 억제와 CCR5 DNA 편집을 동시에 수행했다. RNA 메틸화 효소 METTL3를 결합한 AsCas12a로 표적 RNA의 N6-메틸아데노신(m6A) 변형을 늘리는 응용도 제시했다. RNA 결합 기능에 다른 효소를 연결해 조절 범위를 넓힌 사례다.

진단 실험에서는 역전사 중합효소연쇄반응(RT–PCR)과 T7 전사를 거친 C형간염바이러스(HCV) 양성 20개·음성 20개 검체를 5′ 비번역영역 표적 가이드로 모두 정확히 분류했다. 이는 해당 검체군과 전처리 조건에서 얻은 검출 결과이며, 치료 효과나 일반적인 진단 성능을 확정하는 근거로 확대할 수 없다.

이번 연구는 시험관 내 검출과 인간 세포 기반 도구 개발을 다뤘다. ΨDNA는 플라스미드에서 발현할 수 없어 합성 가이드를 별도로 공급해야 한다. 질환 모델에서의 효능과 체내 전달·안전성은 추가 검증 과제로 남았다. 세부 결과는 논문 전문에서 확인할 수 있다.