10킬로베이스 이상 유전 정보도 단번에 정밀 삽입, 유전자 치료 효율 극대화할 DoPE 기술 공개
배경
유전체 편집 분야에서 이중가닥 절단(Double-Strand Breaks, DSBs)을 유도하지 않으면서 넓은 범위의 DNA 서열을 정밀하게 삽입하는 기술은 유전자 치료의 오랜 과제다. 기존의 크리스퍼(CRISPR-Cas9) 기술은 DNA의 두 가닥을 잘라 세포 자체 복구 기전에 의존하므로 의도치 않은 돌연변이가 발생할 위험을 동반한다. 이를 극복하고자 개발된 프라임 편집(Prime Editing) 기술은 DSBs를 유도하지 않아 안전한 반면, 한 번에 삽입할 수 있는 DNA 크기가 수십 염기쌍 수준으로 좁다는 한계가 있었다.
대용량 DNA 단편을 유전체에 넣기 위해 재조합효소(Recombinase)나 트랜스포사제(Transposase)를 결합하기도 했다. 그러나 이러한 방식은 다단계 편집을 거치며 효율이 떨어지고, 불필요한 흔적 서열을 남겨 임상 적용이 까다로웠다. 대용량 유전 정보를 안전하고 정교하게, 단 한 단계로 유전체에 삽입할 새로운 접근법이 시급했던 이유다.
핵심 발견
연구진은 이러한 한계를 넘고자 공여체-상보적 프라임 편집(Donor-Complementary Prime Editing, DoPE) 기술을 새로이 고안했다. 이 시스템은 삽입 대상 유전 정보를 담은 3'-오버행 이중가닥 DNA(3'-overhang Double-Stranded DNA, odsDNA) 공여체, 이 공여체의 말단 오버행 서열과 결합하는 한 쌍의 오버행 상보적 프라임 편집 가이드 RNA(Overhang-Complementary Prime Editing Guide RNAs, opegRNAs), 그리고 PE2* 프라임 에디터(PE2* Prime Editor, PE2*)를 조합한 구성이다.
DoPE는 약 30개 뉴클레오타이드 수준의 짧은 오버행을 가진 odsDNA 공여체를 활용하여 효율을 높였다. 연구진은 실험으로 작은 단편부터 최대 12.5킬로베이스(kb)에 달하는 유전 물질까지 정밀하게 삽입할 수 있음을 입증했다. 추가 재조합효소 없이 단 한 번의 반응으로 대용량 유전 정보를 유전체에 안착시킨 셈이다.
연구진은 DoPE의 성능을 검증하고자 녹색형광단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) 유전자의 표적 영역을 대상으로 인시튜(in situ) 포화 돌연변이 유발(Saturation Mutagenesis) 실험을 수행했다. opegRNAs 한 쌍과 합성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드로 구축한 공여체 풀을 사용하여 아미노산과 뉴클레오타이드 수준의 정밀한 돌연변이 라이브러리를 구축해냈다.
나아가 DoPE 기술을 활용한 PRKCSH 유전자 돌연변이 복구 시험도 이어졌다. 유전자의 고장 난 엑손(Exon) 부위를 교체하는 실험에서, 연구진은 다양한 돌연변이를 지닌 대립유전자들을 동시에 또는 개별적으로 정상 서열로 바꿨다. 이는 돌연변이 종류에 상관없이 정상 유전자를 삽입하는 돌연변이 무관(Mutation-Agnostic) 치료의 기반을 마련한 성과로 꼽힌다.
의미와 전망
DoPE 기술은 기존 프라임 편집의 대용량 유전자 삽입 한계와 유전체 절단에 따른 위험을 동시에 극복했다. 개별 돌연변이마다 맞춤형 가이드 RNA를 설계하는 번거로움에서 벗어나, 손상되지 않은 거대 유전자 블록을 통째로 삽입하는 범용 유전자 치료법이 가능해질 전망이다. 재조합효소와 같은 외부 인자를 배제하여 임상 적용 시 생체 안전성 측면에서도 큰 이점을 지닌다.
다만 이 기술이 임상 현장에 적용되려면 아직 해결해야 할 과제가 있다. 세포 시험에서 입증한 높은 편집 효율이 살아 있는 동물 체내에서도 균일하게 나타나는지 검증할 필요가 있다. 거대한 크기의 유전 물질과 단백질 복합체를 질환 표적 부위까지 안전하게 배달할 체내 전달체 기술과의 융합도 해결 과제다. 대용량 유전 물질 도입 과정에서 예상치 못한 표적 외 효과(Off-target effect)가 발생하는지 정밀하게 추적하는 장기 연구도 뒤따라야 한다.
Methods for precise genomic DNA insertion that avoid double-strand breaks (DSBs) are constrained by limited throughput or the need for multistep editing. Here we report donor-complementary prime editing (DoPE), which combines a 3'-overhang double-stranded DNA (odsDNA) donor with a pair of overhang-complementary prime editing guide RNAs (opegRNAs) and a PE2* prime editor to achieve precise insertion of DNA sequences up to 12.5 kilobases (kb). Using one opegRNA pair and donor pools constructed from synthesized single-stranded oligonucleotides, we demonstrate in situ saturation mutagenesis across a targeted EGFP region at both amino acid and nucleotide resolutions. DoPE employing short (approximately 30-nucleotide) overhangs supports various insertions ranging from small fragments to those exceeding 10 kb. Furthermore, we replace mutant exons of PRKCSH, either individually or simultaneously, to correct diverse mutations, establishing a mutation-agnostic approach that corrects distinct alleles uniformly in vitro. Our study demonstrates DoPE as a one-step, DSB-free and library-compatible method for precise insertion of large DNA fragments without requiring recombinases or transposases.
DoPE 기술의 실질적인 가치는 희귀 유전 질환 치료제의 개발 방식을 근본적으로 바꾸는 데 있다. 예를 들어 환자마다 유전자 변이 위치가 다양한 혈우병이나 유전성 안과 질환의 경우, 기존에는 환자의 고유한 점돌연변이 부위를 일일이 표적하는 치료제를 설계해야 했다. 반면 DoPE를 활용하면 돌연변이가 자주 일어나는 엑손 전체나 유전자 전체를 정상 서열로 한 번에 교체할 수 있어 동일한 치료 플랫폼으로 여러 환자를 치료하는 범용 치료제 설계가 수월해진다.
아울러 유전체 스크리닝 분석 연구에서의 활용 가치도 높다. 약 30개 염기쌍의 짧은 오버행을 가진 공여체 라이브러리를 설계해 돌연변이 풀을 생성함으로써, 특정 단백질의 구조적 변화가 약물 결합력이나 질병 유발에 미치는 영향을 고해상도로 신속히 스크리닝하는 대용량 신약 후보 물질 발굴 플랫폼 구축에 유용하게 쓰일 전망이다.