背景

レプトスピラ属細菌は人間および家畜にレプトスピローシスを引き起こす病原体である。多くの動物の腎臓に定着し尿中に排出され環境を汚染させるが、病原性および宿主への適応に関わる遺伝子は十分に解明されていない。これは遺伝子機能を直接確認するための突然変異株の作成が困難だったためである。

一般的な細菌ゲノム編集ではCas9が標的DNAの二本鎖を切断し、細胞の修復過程で遺伝子欠損を誘導する。しかし多くのレプトスピラは二重鎖切断（DSB）を適切に修復できない。Cas9が標的を正確に切断しても編集細胞が生存できず、ノックアウト菌株を回収することが困難だった。触媒活性を除去したCas9を用いたCRISPR干渉法は遺伝子発現を抑えることができるが、塩基配列そのものを永続的に変化させる方法ではない。

研究チームはこの限界を異なる原理で補完するCRISPR/Cas9-非ホモログ末端結合（NHEJ）とCRISPRプライム編集（PE）システムを構築した。前者はDSBを作り修復能力を外部から補充し、後者は致死的なDSB自体を回避する。

核心的発見

CRISPR/Cas9-NHEJシステムではCas9とガイドRNAに加えてマイコバクテリウム・スメグマチス由来のDNA修復タンパク質LigDとKuを共発現させた。Kuが切断されたDNA末端を保持しLigDがそれを結合することでレプトスピラに欠如するNHEJ機能を提供する。この修復は正確度が低く標的部位に挿入・欠失（indel）を残し、その結果として遺伝子読枠を破壊するノックアウト突然変異を作成できる。

PEは切断と修復のリスクを減らしながら精度を高めるアプローチである。研究チームは一本鎖のみを切断するCas9ニカーゼに逆転写酵素を融合させた。編集情報を含むプライム編集ガイドRNAが標的を指定すると、逆転写酵素が望ましい配列を新しいDNAに記録する。二本鎖を同時に切らないためDSBに弱いレプトスピラでも細胞生存を保つ可能性が生まれる。

二つのシステムの役割は明確に区別される。Cas9-NHEJは誤りの多い修復を利用してさまざまなindelを迅速に確保するのに適している。一方PEは単一塩基レベルの置換のように結果を事前に設計する必要がある実験に適している。ランダム突然変異の選別や一時的な発現抑制に依存していた従来の研究とは異なり、研究目的に応じて遺伝子破壊と精密修正を選択できるツールボックスが整ったことになる。

意義と展望

新しい編集システムはレプトスピラの病原性因子、代謝経路、環境生存および宿主定着遺伝子を因果的に検証する基盤を広げる。遺伝子を完全に除去した菌株と特定の塩基のみを変更した菌株を比較すれば、タンパク質欠損効果と個々のアミノ酸変化の影響を分離して分析できる。複数の種および血清型間の遺伝子機能の違いを研究するにも応用可能性がある。

ワクチン開発では病原性遺伝子を除去した減毒化生ワクチン候補や抗原生産性が調整された菌株の作成に応用できる可能性がある。ただし現在提示された成果は編集原理とツールの拡張に焦点が当てられている。標的ごとの編集効率、非標的変異、菌株ごとのプラスミド伝達および発現の差異は追加検証対象である。NHEJが作るindelは結果が一定しないため候補菌株の塩基配列を個別に確認する必要があり、PEも標的周辺配列とガイド設計によって性能が変わる可能性がある。動物感染モデルで編集菌株の遺伝的安定性と病原性変化まで確認しないと実際の応用範囲を判断することはできない。