DNAではなくRNAを標的としたぶどう膜黒色腫の研究

CRISPR-Cas13dでRASGRP3 RNAを標的化すると、培養したヒトぶどう膜黒色腫細胞株3種すべてで、処理48時間後の生存率が5%未満に低下した。研究チームはCas13d mRNAとガイドRNAを脂質ナノ粒子（LNP）に同時に封入して送達した。今回の結果は、細胞培養実験で確認された概念実証である。動物や患者における腫瘍の除去や視力の維持は評価していない。研究は学術誌Molecular Therapy Oncologyに掲載された。

ぶどう膜黒色腫は、虹彩・毛様体・脈絡膜のメラノサイトから発生し、成人で最も多い原発性眼内悪性腫瘍である。局所治療には放射線療法や手術が用いられるが、転移性疾患の治療選択肢は限られている。既存薬では狙いにくい細胞内タンパク質を標的とするため、研究チームはそのタンパク質を作るRNAを分解する戦略を試した。

がん細胞の依存性と高い発現を併せて利用

研究者らは、1,000を超えるがん細胞株を含むDepMapのCRISPR遺伝子ノックアウトデータと、TCGA・GTExの発現データを解析し、候補としてRASGRP3を選んだ。この遺伝子はぶどう膜黒色腫で高発現しており、ぶどう膜黒色腫細胞は生存においてこの遺伝子に選択的に依存していた。RasGRP3タンパク質は、がん細胞の増殖に関わるRAS–MAPKシグナル伝達をつなぐが、細胞内に存在し、明確な薬剤結合部位がないため、従来の方法では標的化が難しい。

Cas13dは、ガイドRNAが指定したRNAを切断する酵素である。研究チームはRASGRP3を狙うガイド42種を試験し、g4を選定した。別途、GFP蛍光タンパク質をコードするmRNAを用いてLNP組成30種の送達効率を比較した後、選定したLNPにCas13d mRNAとg4を一緒に封入した。最終製剤は、DNAを恒久的に編集するのではなく、RNA段階で作用するよう設計された。

48時間後、がん細胞株と対照細胞株で反応が分かれた

Cas13d-LNP処理後、フローサイトメトリーで測定した平均生存率は、ぶどう膜黒色腫細胞株92-1で4.73%、MP-41で3.90%、MP-46で2.80%だった。ぶどう膜黒色腫以外の対照細胞株HEK293TとHeLaでは、それぞれ86.33%、84.34%で、非がん性の網膜色素上皮モデルARPE-19では90.73%だった。対照細胞株の生存率は未処理対照群と同程度だった。ただし、対照群には別のがんに由来する細胞株も含まれているため、この結果を正常組織全般の安全性にまで一般化することはできない。

92-1細胞を用いた別の比較実験でも、Cas13dによる生存率の低下は、Cas9による遺伝子ノックアウトやsiRNAによる抑制より大きかった。ただし、送達方法や評価時点などは異なり、研究者らも比較に用いたCas9・siRNAは最適化されていない可能性があると述べた。他の技術に対する一般的な優位性を示す結果と解釈するのは難しい。

標的抑制と周辺RNAの分解が相まって作用

研究者らは、RASGRP3 mRNAの減少と「周辺RNA切断」がともに殺細胞効果に寄与したと解釈した。Cas13dは豊富な標的RNAを切断した後、標的以外のRNAも分解することがある。処理12時間後、一部のがん細胞株では標的ではないGAPDH RNAも明らかに減少したが、ARPE-19ではほとんど変化しなかった。

ガイドに認識されず、同じタンパク質を作るRASGRP3のコピーを追加したレスキュー実験では、生存率が約3%から約46%へ部分的に回復した。この結果は、標的遺伝子の抑制に加えて、周辺RNAの分解も細胞死に寄与するという解釈を裏付ける。

今後の研究では、腫瘍ごとのRASGRP3発現の違い、標的認識の回避による耐性、体内分布、反復投与時の免疫反応を調べる必要がある。眼や肝転移部位への送達も、今後検証すべき課題である。研究設計と結果は、論文全文および書誌・抄録記録で確認できる。