Laドメインを融合した次世代の二重プライムエディター、大規模な遺伝子挿入と遺伝性疾患の治療を同時に実証
背景
遺伝子編集技術は飛躍的に進歩している。特に、第3世代のCRISPR遺伝子ハサミから進化したプライムエディティング（Prime Editing, PE）技術は、DNA二本鎖を完全に切断することなく、目的とする塩基を置換、挿入、または欠失できる次世代ツールとして注目されている。逆転写酵素（Reverse Transcriptase, RT）が融合されたCRISPRモジュールを使用するプライムエディティングは、標的塩基配列を精密に編集する作業に最適化されている。さらに、相補的な2つの逆転写テンプレートを同時に提供し、大規模な遺伝子挿入や欠失を誘導する二重プライムエディティング（Twin Prime Editing, twin-PE）技術が新たに登場している。
しかし、既存の二重プライムエディティングシステムは、有効な編集効率が低いという欠点がある。意図しない挿入・欠失変異（indel）が引き起こされたり、編集結果を事前に予測することが難しいという技術的な限界も課題となっている。治療薬の開発や大規模なゲノムエンジニアリングに実質的に適用するには、効率と精度をともに改善する必要がある。
主要な発見
韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB）の研究チームは、これらの限界を克服するために、SpCas9(H840A)-RTベースの既存のプライムエディター構成要素を新たに設計した。まず、RNAの安定性を高める上で重要な役割を果たすLaタンパク質のRNA結合ドメイン（La domain）をプライムエディターに融合した「La-twin-PE」システムを考案した。さらに、二重プライムエディティングガイドRNA（Prime Editing Guide RNA, pegRNA）の構造を精密に調整し、標的部位へのアクセス性を高めた。
このように設計されたLa-twin-PEは、ヒト由来細胞株のさまざまな遺伝子座で、既存の技術よりも1.75 ± 0.21倍高い編集効率を記録した。注目すべきは、標的以外の塩基配列が損傷したり、非特異的な変異が発生したりするなど、不正確な編集が増加しなかったことである。
新型遺伝子ハサミの実用性を評価するための大規模な遺伝子挿入実験も成功裏に実施された。研究チームは約2.8キロベース（kb）の緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein, GFP）遺伝子を標的ゲノム部位に正確に挿入（knock-in）することに成功した。さらに、この技術を代表的な変性性脳疾患である小脳失調症3型（Spinocerebellar Ataxia type 3, SCA3）の治療に応用した。SCA3患者は、ATXN3遺伝子内のCAG塩基配列が異常に長く繰り返され、毒性のある多グルタミン（polyQ）タンパク質が蓄積するという問題を抱えている。La-twin-PEは、患者由来の細胞において、この異常なpolyQ繰り返し配列をきれいに切断する結果を示した。
意義と展望
今回の研究は、プライムエディティングの汎用性を広げたとして評価されている。既存の遺伝子ハサミが単一塩基レベルの編集に集中していたのに対し、La-twin-PEは、数キロベースに及ぶ遺伝子を直接標的部位に挿入したり、病因遺伝子を切断するなど、幅広い選択肢を提供する。
学界では、特にLaドメインを融合してpegRNAの細胞内半減期を延長し、複合体の形成を安定化させた分子設計手法に注目している。今後、他の形態のCRISPR変異遺伝子ハサミを開発する際にも、有用な基盤となるだろう。
ただし、臨床段階に進む前に解決すべき課題も存在する。数kb規模の巨大な遺伝子を挿入する効率は、依然として実質的な治療レベルに達していないため、生体内への送達のためのベクターシステムの最適化が求められる。さらに、標的遺伝子座によって編集効率のばらつきが生じる現象についても、原因を突き止める必要がある。生体内での標的逸脱効果（off-target effect）による長期的な安全性を検証するフォローアップ研究が行われれば、真の治療薬として発展できるだろう。
Recent advances in prime editing technologies using CRISPR modules fused with reverse transcriptase (RT) have enabled efficient and precise reprogramming of target genomic sequences. Twin prime editing using two coordinated prime editor complexes is a promising strategy for inducing extensive genomic modifications via reverse-transcribed complementary templates. However, current twin prime editing systems still require improvements in editing efficiency, accuracy, and intended edit predictability. Here, efficiency and precision of twin prime editing were enhanced via engineering and optimizing conventional SpCas9(H840A)-RT-based prime editor (twin-PE) components. A La-domain-fused prime editor (La-twin-PE) and optimized prime editing guide RNAs (pegRNAs) were developed, achieving a 1.75 ± 0.21-fold increase in gene editing efficiency at multiple genomic loci in human-derived cell lines without increasing unintended indel or inaccurate editing. La-twin-PE facilitated efficient ∼2.8 kb GFP transgene knockin at target loci and eliminated the expanded polyQ tract in
La-twin-PE技術は、既存の薬物療法では事実上不可能だった難治性の希少疾患の遺伝子治療薬の開発に直接応用できる。特に、小脳失調症3型やハンチントン病のように、特定の塩基配列の異常な繰り返しによって生じる三核酸繰り返し疾患（Trinucleotide Repeat Disorders）の場合、繰り返し配列自体を切断する根本的な治療が可能になる。
具体的には、患者の幹細胞を採取し、体外でLa-twin-PEを用いて病因遺伝子を正常化し、再び移植する細胞治療薬の開発が有望である。また、作成された遺伝子治療物質をアデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Virus, AAV）や脂質ナノ粒子（Lipid Nanoparticle, LNP）に搭載して、患者の中枢神経系に送達する生体内（in vivo）治療シナリオも現実味を帯びている。これは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのように、遺伝子変異のサイズが大きく治療が困難だった難病にも有用な突破口となるだろう。