プライムアセンブリ技術により、遺伝子損傷なしに数千塩基対規模の遺伝子治療物質を成功裏に移植
背景
ヒト細胞内で大規模な遺伝子断片を置き換えたり挿入したりする技術は、ゲノム編集分野における長年の課題であった。従来のゲノム編集技術は数十塩基対の微細な修正には有用だが、正常遺伝子の挿入においては効率が大きく低下していた。特に、大規模な遺伝子を移植するために二重鎖切断（Double-Strand Break, DSB）を誘導する際には、遺伝毒性が大きな原因となる。特に、細胞分裂を停止した分化細胞では、遺伝子治療物質の導入自体がほぼ不可能に近い状況であった。プライム編集（Prime Editing, PE）技術が新たな代替として注目されたが、これも挿入可能なサイズが数百塩基対程度にとどまっていた。そのため、ゲノム損傷を防ぎながら大きな遺伝子断片を正確に挿入できるプラットフォームの開発が急務とされた。 Seoul National University Medical Schoolの裵相洙教授研究チームは、従来のプライム編集器の原理を応用して、この限界を克服する新たなアプローチを提示した。
核心的発見
研究チームはプライム編集器を応用し、標的ゲノムとドナーDNAの両方にそれぞれ1対または2対の単一鎖3'末端フランプ（3'-flap）を生成する修正技術を構築し、これをプライムアセンブリ（Prime Assembly, PA）と名付けた。この3'末端フランプはお互いに完全に適合するように設計されており、試験管内で複数のDNA断片を組み立てるギブソンアセンブリ（Gibson Assembly）技法のように、細胞内で精密な結合を誘導するメカニズムを持つ。この技術を活用して、メガベース単位のゲノム領域を編集したり、キロベース規模の遺伝子を希望する部位に正確に移植することが可能になった。PAは1.0から6.5キロベース（kb）のサイズのプラスミドDNAおよび線形二重鎖DNAをすべてドナー遺伝子として導入できる広範な汎用性が特徴である。研究チームはヒト胚性腎細胞（Human Embryonic Kidney 293T, HEK293T）において2.9kbのドナーDNA断片で標的ゲノム領域を置き換える実験を実施し、最大57.8％の置き換え効率を証明した。また、挿入されたDNA断片の正確さも90％を超える数値を記録した。さらに、ヒト一次T細胞（primary human T cell）にキメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）遺伝子を特定の部位に移植する実験でも28.1％の挿入効率を達成した。マウスモデルに緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein, GFP）遺伝子を搭載したPAを水動的注入（hydrodynamic injection）方式で体内に投与した場合、肝細胞における遺伝子挿入効率は平均4.3％の水準であった。これは試験管レベルの細胞研究を越えて、実際の動物体内組織でも大規模遺伝子の挿入が機能することを証明した結果として評価される。従来の手法とは異なり、有害な突然変異副産物をほとんど生成しない点も注目される。
意義と展望
従来の遺伝子挿入技術は、細胞毒性や標的外挿入（off-target integration）などのリスク要因により、実際の治療薬適用段階でブレーキがかけられる傾向があった。PAは二重鎖切断なしで遺伝子を結合させるため、突然変異や異常な前位反応を排除し、安全性の確保に寄与すると考えられる。ゲノム全体を修正する必要がある希少遺伝病治療薬の開発に有用な手段が整ったことになる。ただし、動物実験で観測された肝細胞遺伝子挿入効率が4.3％にとどまっているため、治療効果を最大化するには効率向上の研究が続く必要がある。脂質ナノ粒子（Lipid Nanoparticle, LNP）やアデノ関連ウイルス（Adeno-Associated Virus, AAV）などの送達技術を高度化し、体内送達効率を最大化する課題が残っている。
ヒト細胞内で大規模な断片を置き換えることは依然として大きな課題である。本研究では、プライムエディターを適応して、ゲノムとドナーDNAの両方に1対または2対の3'-フランプを生成するプログラム可能な遺伝子置換ツール、プライムアセンブリ（PA）を提示した。これらの3'-フランプはDNAオリゴヌクレオチドにおけるギブソンアセンブリと同様に正確にアニールし、メガベース規模のゲノム除去および/またはキロベース規模のドナー挿入を興味のある遺伝子に可能にする。PAは1.0から6.5 kbのサイズのDNAプラスミドおよび線形二重鎖DNAをドナーとして受け入れる。我々は、HEK293T細胞内で2.9-kbのドナーDNA断片により内因性配列を置き換える効率が最大57.8％であり、統合されたPA断片の正確さが90％を超えることを示した。さらに、PAは一次ヒトT細胞におけるサイト特異的キメラ抗原受容体の統合効率が最大28.1％であることを示した。GFPドナーを含むPAをマウスに水動的注入により送達した場合、GFP陽性肝細胞における平均統合効率は4.3％であった。
PA技術は、臨床現場で体外（ex vivo）細胞治療薬の製造工程を単純化する大きな可能性を持つ。次世代免疫がん治療薬であるCAR-T（Chimeric Antigen Receptor T）細胞治療薬の製造プロセスが代表的な適用シナリオである。従来は患者のT細胞にCAR遺伝子を導入するためにレンチウイルスを活用していたが、ゲノムがランダムに挿入されるためがんを引き起こす副作用のリスクがあった。一方、PAは特定の部位に正確にCAR遺伝子を配置するため、安全かつ効能が一貫した治療薬を大量生産する基盤を提供する。臨床研究でT細胞修正効率28.1％を記録したことは、非ウイルス性CAR-T治療薬の実用化にとって重要なマイルストーンとなる。また産業的にも大規模プラスミドや線形DNAを柔軟に活用できるため、製造単価を削減し、製造プロセスを単純化する利点が期待される。