Twin Prime Editingを用いたSwap-seq、非コードゲノムのエンハンサー・サイレンサー制御メカニズムを解明
背景
ヒトゲノムの98%を占める非コード（noncoding）領域は、遺伝子発現を司る核心的な調節盤である。この領域には、転写を促進するエンハンサー（enhancer）、抑制するサイレンサー（silencer）、3次元的なクロマチン構造を区画化する絶縁体（insulator）など、多様な調節配列が存在する。多くの疾患関連遺伝子変異が非コード領域に位置していることが明らかになっているが、各調節要素が標的遺伝子の発動に与える定量的な影響を把握することは、長年の難題であった。
研究チームは、主に大量並列レポーターアッセイ（massively parallel reporter assay, MPRA）に依存してきた。しかし、外来性プラスミドは実際のクロマチンにおける3次元的な折り畳みやエピジェネティックな環境を反映できないという明確な限界があった。その後、CRISPR干渉（CRISPR interference, CRISPRi）スクリーニングが導入されたものの、抑制信号の拡散により、個々の要素の精密な効果を分離して測定するには制約が伴っていた。そのため、固有のクロマチン文脈において多数の調節要素を精密に欠失させ、発現変化を追跡できる新しいプラットフォームが求められていた。
主な発見
米国スタンフォード大学のジェシー・エングライツ（Jesse Engreitz）教授らの研究チームは、Twin Prime Editing（twinPE）とフローサイトメトリーを組み合わせた大規模スクリーニングプラットフォーム「Swap-seq」を構築した。2つのプライム編集ガイドRNA（pegRNA）を組み合わせ、二本鎖切断を伴わずに数百塩基対を欠失させるtwinPEを適用した戦略である。研究チームは、ヒト単球性白血病細胞株（THP-1）の内因性ゲノムにおいて、数百個の調節候補配列を欠失させた。その後、フローサイトメトリー（fluorescence-activated cell sorting, FACS）によって細胞を分離し、シーケンシングによって欠失の影響を定量的に測定した。
最初の標的として、ペプチジルプロリル cis-trans イソメラーゼF（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase F, PPIF）遺伝子座を分析した結果、PPIF周辺の遠位部およびイントロン内部のエンハンサーの定量的活性を精密に測定することに成功した。また、クロマチン3次元構造を形成するCCCTC結合因子（CCCTC-binding factor, CTCF）絶縁体の機能的な境界線も鮮明に区別された。
特に研究チームは、遠位部の遺伝子発現を抑制する新規のサイレンサーを特定した。このサイレンサーは、周囲のエンハンサーに作用するヒストン脱アチチル化酵素（histone deacetylase, HDAC）を介した経路を通じて、遠隔遺伝子の転写を抑制するメカニズムを持つことが明らかになった。同様のエピジェネティックな特徴を持つサイレンサーが、ゲノム全体に数百個以上分布していることも確認された。
さらに、研究チームはSwap-seqのデータを「配列から機能（sequence-to-function）」を予測するディープラーニングモデルの検証に投入した。深層ニューラルネットワークモデルは、個々の要素の局所的なクロマチン活性は捉えたものの、遠位の標的遺伝子との長距離相互作用および発現変化を関連付けるという課題においては、明確な予測の限界を露呈した。
意義と展望
Swap-seqは、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体といった多様な非コード要素を、同一の内因性ゲノム文脈において体系的に評価する道を開いた。これは、複合疾患の遺伝子変異の発症メカニズムを解明し、標的遺伝子との因果関係を確立する機能ゲノミクス研究における新たな転換点である。長距離相互作用の予測失敗の原因を実測データによって明らかにすることで、次世代のゲノムディープラーニングモデルの高度化を導く重要な基準データを提供した。
全ゲノムへの拡張という観点では、解決すべき技術的課題も存在する。研究チームの説明によれば、twinPEの編集効率はクロマチンのアクセシビリティや配列特性によって偏差が生じる可能性がある。単一の遺伝子座の分析を超えてゲノム全体の調節要素へと拡張するためには、スクリーニングの規模とシーケンサーのコストを削減する必要がある。多様な疾患細胞モデルやオルガノイドへとプラットフォームを拡張し、細胞型別の調節マップを完成させる後続の研究が待たれる時期である。
Noncoding regulatory elements in the human genome can control gene expression through distinct mechanisms, including acting as enhancers, silencers, or topological elements. However, we lack tools to identify all such classes systematically and quantify their effects on gene expression in an endogenous genomic context. Here we develop Swap-seq, a method that combines pooled twin prime editing with flow-sorting to delete hundreds of endogenous regulatory sequences and measure their quantitative effects on the expression of a nearby gene. We apply Swap-seq to dissect the regulatory elements that control
今回の成果は、疾患の原因となる遺伝子変異の大部分を占めながらも、機能解明が困難であった非コード領域の標的発見を加速させると期待される。ゲノムワイド関連解析（GWAS）によって特定された自己免疫疾患や癌の感受性に関連する非コード変異が、実際にどの細胞型において核心的な遺伝子を撹乱しているのかを明確に立証できるためである。創薬の現場においては、異常に過剰活性化された疾患エンハンサーや、抑制メカニズムを持つサイレンサーを精密なターゲットとして指定し、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）や低分子エピジェネティック制御薬を設計する戦略が可能になる。また、細胞・遺伝子治療の分野において、治療遺伝子の発現レベルを患者に合わせて微調整する人工合成プロモーターやエンハンサーの最適化においても、重要な実測指標として活用されることになる。