三次元質量分析法により、RNA治療薬の包括的な分析が可能に：微量不純物やメチル化変異を含む
背景
RNA治療薬市場の急速な拡大に伴い、最終製品の純度と配列の正確性を検証する必要があるため、品質管理がより困難になっています。CRISPR/Cas9システムで使用されるRNA干渉剤（siRNA）やシングルガイドRNA（sgRNA）は、化学修飾を受けることがよくあります。分子レベルでのわずかな変動や微量の不純物は、治療効果を低下させ、予期せぬ免疫反応を引き起こす可能性があるため、正確な分析が不可欠です。
既存のバイオ産業では、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を使用してRNA配列を検証してきました。しかし、既存のLC-MS/MS分析は、事前に設計されたターゲット配列との一致の有無を確認することに限定されています。事前に知識がない状態で、サンプル情報を最初から最後まで解読するデノボ配列決定はできません。その結果、予期しない場所でのわずかな変動や予期しない塩基修飾が分析プロセス中に検出されず、単に無視されてしまうという限界があります。
主要な発見
最近、学術界はこれらの分析上の限界を克服するために、新しいタイプのシーケンシングプラットフォームを提案しました。研究者によって開発された三次元次世代質量分析ベースのシーケンシング（3D NGMS-Seq）技術は、複雑な混合RNAサンプルを分析し、ほぼ100％の精度で配列を直接読み取ります。
研究者らは、既存の二次元データ構造である質量値と保持時間（tR）に、「MS強度」を3番目の変数として組み合わせています。制御された酸加水分解を受けたRNAサンプルは、さまざまな長さのラダーフラグメントに分解され、質量-強度-tRの三次元層に分散されます。複雑で混合されたデータの中で、研究者らは、親RNAの存在量と、切断されたフラグメントのシグナル強度を一致させるネストされたアルゴリズムを適用し、個々のRNA成分を計算によって分離します。
各層で分離されたフラグメントは、隣接するフラグメント間の正確な質量差に基づいて、一度に1つの塩基ずつ塩基呼び出しを受けます。標準的なヌクレオチドだけでなく、化学的に修飾されたメチル化された塩基も逐次的に識別され、その後、完全長のRNA配列に再構築されます。この技術は、合成siRNA、マイクロRNA（miRNA）、sgRNAを使用した検証実験で優れた性能を示しました。特に、既存の分析方法ではほとんど識別できなかった、わずかなメチル化異性体であるUmとmU、およびAmとmAの位置的な曖昧さを明確に解決しました。さらに、混合物中の各RNAの相対量と、特定の場所での修飾の比率を数値データとして定量化することができました。
意義と展望
本研究は、設計された配列情報の事前入力なしに、未知のRNA混合物を正確に分析するための基盤を確立した点で重要です。製薬会社は、この技術を使用して、候補物質の選択の初期段階から、構造異性体や微量の不純物を透明性をもって監視できます。これは、複雑なオリゴヌクレオチド薬の化学組成を完全に制御することを要求する規制当局の厳しい承認基準を満たす上で、大きな助けとなると予想されます。
ただし、臨床および商業製造サイトに完全に導入する前に、いくつかの技術的な改善が必要です。現在の三次元計算分離アルゴリズムは、大規模生産プロセスにおける大量のサンプルのリアルタイム分析において、処理速度と分析スループットの点でボトルネックになる可能性があります。また、複雑な化学修飾が高密度に存在する長鎖RNA分子を分析する際に、デコードの精度を維持するために、シーケンシングアルゴリズムを改善する必要があるという課題もあります。
RNAを基盤とする治療法の急速な発展に伴い、微量なものや修飾されたものを含む、すべてのRNA種の正確な配列決定が求められている。従来のLC-MS/MSは、通常、分析されたサンプルからRNA配列を新規に決定するのではなく、事前に定義されたターゲット配列のみを確認するため、共存する不純物や修飾を見逃してしまう。本研究では、混合RNAサンプルの新規直接配列決定を可能にする、三次元次世代質量分析に基づくシーケンシングプラットフォームである3D NGMS-Seqを提示する。このプラットフォームは、本質的に100%の配列精度を実現する。この方法は、質量強度を従来の二次元質量-保持時間（tR）分析に組み込み、ラダーフラグメントの強度と親RNAの量を整列させるネストされたアルゴリズムを導入することで、計算による分離を行う。制御された酸加水分解によりRNAラダーフラグメントが生成され、これらは質量-強度-tR層に分離される。各層内では、隣接するラダーフラグメント間の質量差から、各ヌクレオチド（標準または修飾）を逐次的に塩基配列決定することにより、短いリードが新規に生成され、その後、完全長のRNA配列に組み立てられる。加水分解速度論と統計モデリングに基づいて、3D NGMS-Seqは、合成siRNA、miRNA、およびCRISPR/Cas9 sgRNAを正確に配列決定し、予期せぬ低濃度のRNA不純物を明らかにし、微妙なメチル化の曖昧さ（Um対mU；Am対mA）を解消するとともに、各RNAの相対的な存在量と部位特異的な修飾の定量的なプロファイルを提供する。3D NGMS-Seqは、事前の配列情報なしで、異質なRNAの直接的かつ偏りのないシーケンシングを可能にし、現在のRNA分析における主要な限界に対処し、小RNA医薬品の開発、品質管理、および規制検証を支援するための強力なツールを提供する。
この技術は、バイオ医薬品製造プロセスの品質管理（QC）ステップを自動化し、安全性を最大限に高めるために、直ちに適用できます。例えば、CRISPR遺伝子治療の製造プロセスにおいて、ガイドsgRNAの化学修飾の分布が不均一な場合、オフターゲット遺伝子切断と呼ばれる致命的な有害事象が発生します。製薬会社は、3D NGMS-Seqを使用して、合成プロセス直後にサンプルを収集し、ガイドRNAの塩基配列エラーとメチル化修飾パターンを徹底的に調査するプロセスを運用できます。事前に配列情報がなくても、合成プロセス中に生じる予期せぬ低濃度不純物を正確に特定し、バッチ間の品質変動を最小限に抑え、潜在的に有害な不純物を含む製品の出荷を防ぐ、強力な製造プロセス制御ツールとして機能します。