3차원 질량 분석 기술을 사용하여 RNA 치료제 내 미세 불순물 및 메틸화 변이를 포괄적으로 분석
배경
RNA 치료제 시장이 빠르게 성장함에 따라 완제품의 순도와 서열 정확성을 검증하는 품질 관리의 중요성이 더욱 커지고 있다. 소형 간섭 RNA(siRNA) 또는 CRISPR/Cas9에 사용되는 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 같은 RNA는 화학적 변형이 빈번하게 발생한다. 분자 수준에서 발생하는 미세한 변형이나 극미량의 불순물은 치료 효능을 저하시키고 예기치 않은 면역 반응을 유발할 수 있으므로 정밀한 분석이 필요하다.
기존 바이오 산업에서는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석(LC-MS/MS) 장비를 사용하여 RNA 서열을 검증해 왔다. 그러나 기존 LC-MS/MS 분석은 미리 설계된 표적 서열과 비교하여 일치 여부만 확인하는 방식에 그쳤다. 샘플 내 정보를 사전 지식 없이 처음부터 끝까지 해독하는 신규 서열 규명(de novo sequencing)이 불가능했기 때문이다. 따라서 분석 과정에서 기존 설계와 미세하게 다른 유사 불순물이나 예상치 못한 위치의 염기 변형을 감지하지 못하고 놓치는 한계가 있었다.
핵심 발견
최근 학계에서는 이러한 분석 한계를 극복하기 위해 새로운 형태의 시퀀싱 플랫폼이 제시되었다. 연구진이 개발한 3차원 차세대 질량 분석 시퀀싱(3D NGMS-Seq) 기술은 복잡한 혼합 RNA 샘플을 분석하여 서열을 거의 100%에 달하는 정확도로 직접 읽어낸다.
연구진은 기존의 질량 값과 머무름 시간(Retention Time, tR)이라는 2차원 데이터 구조에 '질량 분석 신호 강도(MS intensity)'를 세 번째 변수로 결합했다. 화학적으로 제어된 산 가수분해(controlled acid hydrolysis)를 거친 RNA 샘플은 다양한 길이의 래더(ladder) 단편 조각으로 분해되어 질량-강도-tR의 3차원 레이어로 분산된다. 복잡하게 섞인 데이터 속에서 연구진은 모체 RNA의 풍도와 잘려 나간 단편들의 신호 강도를 정렬하는 중첩 알고리즘(nested algorithm)을 적용하여 개별 RNA 성분을 전산적으로 분리해 냈다.
각 레이어별로 분리된 단편들은 인접한 조각 간의 정밀한 질량 차이를 토대로 염기를 하나씩 호출(base-calling)한다. 표준 뉴클레오타이드는 물론이고 화학적으로 변형된 메틸화 염기까지 순차적으로 규명된 뒤, 최종적으로 전체 길이의 RNA 서열로 재조립되는 방식이다. 이 기술은 합성 siRNA, 마이크로 RNA(miRNA), sgRNA 등을 대상으로 수행한 검증 실험에서 뛰어난 성능을 보였다. 특히 기존 분석법으로는 식별이 거의 불가능했던 미세한 메틸화 이성질체인 Um과 mU, Am과 mA의 위치적 모호성을 명확히 해결해 냈다. 더불어 혼합물 내 개별 RNA의 상대적인 양과 특정 위치의 변형 비율을 수치 데이터로 정량화하는 성과를 거두었다.
의미와 전망
이번 연구는 설계 서열 정보를 미리 입력하지 않고도 미지의 RNA 혼합물을 정밀하게 분석할 수 있는 기반을 마련했다는 점에서 의미가 깊다. 신약 개발사들은 이 기술을 활용하여 초기 후보 물질 도출 단계에서부터 미량의 구조적 이성질체와 불순물을 투명하게 모니터링할 수 있다. 이는 복잡한 올리고뉴클레오타이드 제제의 화학적 조성을 완벽히 통제해야 하는 규제 기관의 엄격한 승인 기준을 충족하는 데 큰 도움을 줄 것으로 예상된다.
다만 임상 및 상업적 제조 현장에 전면 도입되기 위해서는 몇 가지 기술적 보완이 필요하다. 대규모 생산 공정에서 대량의 샘플을 실시간으로 분석하기에는 현재의 3차원 전산 분리 알고리즘 연산 속도와 분석 처리량이 병목 구간으로 작용할 가능성이 크기 때문이다. 복잡한 화학적 변형이 고밀도로 축적된 긴 사슬 RNA 분자를 분석할 때 해독 정확도를 유지할 수 있도록 시퀀싱 알고리즘을 고도화하는 과제도 남아 있다.
RNA 기반 치료제의 급속한 성장은 모든 RNA 종, 특히 미세하고 변형된 변종에 대한 정확한 시퀀싱을 요구한다. 기존의 LC-MS/MS는 일반적으로 미리 정의된 표적 서열만 확인하고 분석된 샘플에서 RNA 서열을 de novo로 결정하는 것이 아니므로, 공존하는 불순물과 변형을 간과한다. 본 연구에서는 복잡한 혼합 RNA 샘플의 서열을 거의 100%의 정확도로 직접 시퀀싱할 수 있는 3차원 차세대 질량 분석 기반 시퀀싱 플랫폼인 3D NGMS-Seq를 제시한다. 이 방법은 MS 강도를 기존의 2차원 질량-머무름 시간(tR) 분석에 통합하고, 모체 RNA 풍도와 잘린 단편의 강도를 정렬하여 개별 RNA 성분을 전산적으로 분리하는 중첩 알고리즘을 도입한다. 제어된 산 가수분해는 RNA 래더 단편을 생성하며, 이는 질량-강도-tR 레이어로 분리된다. 각 레이어 내에서 짧은 리드는 인접한 단편 간의 질량 차이를 기반으로 각 뉴클레오티드, 표준 또는 변형된 뉴클레오티드를 순차적으로 호출하여 전체 길이의 RNA 서열로 재조립함으로써 de novo로 생성된다. 가수분해 동역학과 통계적 모델링을 통해 3D NGMS-Seq는 합성 siRNA, miRNA 및 CRISPR/Cas9 sgRNA를 정확하게 시퀀싱하고, 예상치 못한 저농도 RNA 불순물을 밝혀내며, 미세한 메틸화 모호성(Um 대 mU; Am 대 mA)을 해결하고, 각 RNA의 상대적 풍도와 특정 위치의 변형 비율에 대한 정량적 프로필을 제공한다. 사전 서열 지식 없이 이질적인 RNA를 직접적이고 편향되지 않게 시퀀싱함으로써 3D NGMS-Seq는 현재 RNA 분석의 주요 한계를 해결하고 소형 RNA 약물 개발, 품질 관리 및 규제 검증을 지원하는 강력한 도구를 제공한다.
이 기술은 바이오 의약품 생산 공정의 품질 관리(QC) 단계를 자동화하고 안전성을 극대화하는 시나리오에 즉시 적용할 수 있다. 예를 들어 CRISPR 유전자 치료제 생산 공정에서 가이드 sgRNA의 화학적 변형 분포가 불균일하면 표적 외 유전자 절단(off-target)이라는 치명적인 부작용이 발생한다. 제약사는 3D NGMS-Seq을 활용하여 합성 공정 직후 시료를 수거하여 가이드 RNA의 염기 서열 오류와 메틸화 변형 패턴을 전수 조사하는 공정을 운용할 수 있다. 사전 서열 정보가 없더라도 합성 과정에서 도출된 예상외의 저농도 불순물까지 정밀하게 식별하므로, 배치(batch) 간 품질 편차를 최소화하고 부작용 가능성이 있는 불순물 함유 제품의 출하를 미연에 방지하는 강력한 제조 공정 통제 도구로 기능하게 된다.