プライム編集によるネクチン1機能部位の改変でブタ細胞にPRV抵抗性を付与：機能的ノックアウト構成に基づく宿主・ウイルス間のドッキング挙動の阻止と、次世代家畜向け計算遺伝子工学フレームワーク
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宿主受容体の完全除去による生理機能の破綻と、遺伝的な抗ウイルス品種設計のボトルネック ブタ産業の経済的生産性を脅かすオーエスキー病ウイルス（Aujeszky’s disease virus、PRV）は、アルファヘルペスウイルス亜科に属するエンベロープを持つ二本鎖DNAウイルスです。この病原体は細胞表面の接着分子ネクチン1（Nectin-1）を主要な宿主受容体として認識し、エンドサイトーシス誘導および膜融合経路を作動させます。従来の遺伝子工学ガイドラインは、ウイルス感染を根本から阻止するため、ネクチン1のコード遺伝子全体を破壊する従来型ノックアウト（KO）戦略に依存してきました。しかし、この単純な切断方式には重大な盲点がありました。細胞間接着や上皮組織形成など、ネクチン1本来の生理的・発生的機構を機能不全にし、動物個体の発生致死や偽陽性の奇形スペクトラムを引き起こすという点です。タンパク質の内在的な有益機能を保ちながらウイルス侵入だけを選択的にふるい分ける、可逆的な微小ドメイン工学技術の欠如は、持続可能な疾病抵抗性家畜の育種パイプライン開発を長年阻んできました。
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プライム編集によるネクチン1のgD結合部位の4アミノ酸精密リプログラミング 近年のゲノム工学研究では、受容体の完全喪失に伴う発生性細胞毒性を根本から解消するため、DNA二本鎖切断（DSB）を起こさずに標的塩基を精密に置換、挿入、欠失できる次世代プライム編集（PE）システムを全面的に導入しました。研究チームは、先行する構造・生化学研究でPRV糖タンパク質D（gD）との結合に関与すると確認されていたネクチン1のN77、I80、M85、F129残基を標的としました。この4つの主要なアミノ酸残基の座位に対してプライムエディターガイドRNA（pegRNA）を設計し、片方の対立遺伝子のみの微小変異とホモ接合性の微小変異を高効率で導入することに成功しました。
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ウイルス侵入挙動におけるトポロジー上の失速機構を実証し、機能的ノックアウトを確立 作製したプライム編集ブタ細胞株でPRV感染感受性の動態を追跡した結果、特有の「機能的ノックアウト」表現型が完全に検証されました。改変ネクチン1受容体の構造は、外部のPRV粒子が細胞表面に物理的に付着する初期吸着の動態を正常に許容しました。一方、gDタンパク質とのアロステリックな構造適合を拒み、ウイルスゲノムが細胞膜を通過して内部化される下流の律速段階を強く抑えました。特に、X3を先に作製してから追加編集する逐次戦略で得られた4標的残基変異モデルX4では、変異タンパク質がトランス二量体形成と接着結合の支持機能を完全に保持するかどうかは、まだ確認されていません。ただし、試験条件下では、ウイルスの内部化、細胞内複製、子孫ウイルスの放出は従来型ネクチン1 KO細胞株と同程度で、両群間に統計的に有意な差は認められませんでした。
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プログラム可能なスマート育種インフラの規格化と農業・畜産のバイオセキュリティ基準の確立 農業遺伝学と合成生物学を統合した本データ白書は、家畜防疫のガバナンスを、事後的な飼料添加剤や衛生隔離方式から「宿主ゲノムコードのスキャンに基づくプログラム可能な感染抑制インフラ」へと全面的に刷新しました。オフターゲット解析では、各sgRNAについて予測された上位3つの候補部位を、編集細胞のゲノムDNAから2段階ネステッドPCRで増幅し、ハイスループットシーケンシングで調べました。確立されたネクチン1プライム編集の補正係数と構造動態の数値は、今後、次世代トランスジェニック家畜のIND承認経路でCMC（化学・製造・品質管理）の安全性指標を先行算出するための基盤となり、持続可能で環境に配慮した抗ウイルス育種事業に対する世界の規制当局の承認期間を飛躍的に短縮するマスターレファレンスとして機能します。
BACKGROUND: 疑似狂犬病ウイルス（PRV）の継続的な進化と種間伝播リスクは、豚産業および公衆衛生に対して重大な脅威をもたらしています。PRV侵入に必須の宿主受容体であるNectin-1は有望な抗ウイルスタゲットとされていますが、直接的な遺伝子ノックアウト（KO）はバイオセーフティ上の懸念があり、従来のゲノム編集手法では重要機能残基の正確な多重修飾が非効率的です。 RESULTS: 本研究ではPrime editing（PE）を用いてPRV侵入受容体Nectin-1を体系的に再設計し、gD結合インターフェース内の構造的に定義された4つのアミノ酸残基に対して単独および組み合わせの点変異を導入しました。PEはこれら機能的に重要な残基のホモ接合性多重編集を豚細胞で高効率に実現しました。機能解析の結果、これら標的変異はウイルスの内部化を特異的に阻害し、付着には影響を与えず、組み合わせ効果によりウイルス増殖と放出が減少することが示されました。特に四重変異体はNectin-1 KO細胞と同等の耐性レベルを付与しました。 CONCLUSION: 本研究は「Functional Knock-out」の枠組みを確立し、必須微小ドメインの精密編集によりタンパク質の完全性を保ちつつウイルス感染に対する抵抗性を付与する戦略を示しました。これらの知見はin vitro細胞モデルに基づくものであり、今後のin vivo検証を経て、より安全で制御可能な抗ウイルスゲノム編集育種への応用が期待されます。
本研究のゲノム工学上の発見は、理論的な技術蓄積を超え、世界の畜産バイオテクノロジー供給網やB2Bの家畜遺伝資源事業に直接活用されます。ネクチン1変異ブタ細胞株X4ではPRV複製は完全には排除されませんでしたが、細胞内のウイルスゲノム蓄積、子孫ウイルス産生、ウイルス拡散は、ネクチン1 KO細胞と同程度まで減少しました。同時に、プライム編集による高効率な単一塩基修正の動態を連動させることで、複数の対立遺伝子にまたがる複合変異の誘導時に生じる偽陽性の染色体破綻ノイズを仮想シミュレーションし、標的細胞の形質転換の完全性に関わる濃度を調整するプラットフォームインターフェースが実現します。さらに、こうした精密なネクチン1変異を持つ遺伝子編集ブタを作製し、生体内でPRV感染感受性が低下するかどうか、潜在的な生理的影響、および長期的なバイオセーフティを評価する必要があります。