マウス由来逆転写酵素を改変したプライムエディター、編集困難な標的で平均1.88倍の効率
背景：逆転写酵素が左右するプライムエディティング効率
マウス由来の逆転写酵素を改変したプライムエディターは、試験したヒト細胞とイネのプロトプラストで、既存ツールより高い編集効率を示した。研究チームが開発したenRERV-RTベースのシステムは、一般的な内在性標的の比較で平均1.20倍、編集が難しい4つの内在性標的では平均1.88倍の効率を記録した。これは細胞および植物での実験結果であり、患者における治療効果を評価した研究ではない。
プライムエディティングは、DNA二本鎖切断を起こさずに、目的の塩基置換や短い配列の挿入・欠失を導入する技術だ。DNAの片鎖にニックを入れるCas9変異体、逆転写酵素（RT）、編集情報を担うプライムエディティングガイドRNA（pegRNA）が連携する。RTは、RNAに記された編集情報をDNAへ写し取る中核部品である。効率の高い酵素の選択肢が限られているため、研究チームは広く使われているモロニー・マウス白血病ウイルス由来RT（M-MLV-RT）に代わる候補を探した。
主な発見：候補探索から編集困難な標的での検証まで
研究チームはデータベースから選んだ重複のないRT配列558件を系統解析し、代表候補54種をイネのプロトプラストで試験した。蛍光レポーターで活性が確認された酵素は19種だった。その後の内在性標的での評価では、マウス内在性レトロウイルス由来のRERV-RTが最も高い活性を示した。
酵素の改変では、AlphaFold 3で予測したRERV-RTの構造と、M-MLV-RTのクライオ電子顕微鏡構造を比較した。まず5つの変異を導入したRERV-m5を作製。これに、網羅的変異スキャニングで見いだしたW149Fと、追加の有益な変異Y68R・C413Rを組み合わせた最終酵素がenRERV-RTである。
M-MLVベースのエディターと比べ、ヒト胎児腎由来HEK293T細胞の7標的では平均1.17倍、イネのプロトプラストの6標的では平均1.22倍の編集効率を示した。2つの実験系、計13標的での平均相対効率は1.20倍だった。HeLa細胞と初代ヒト皮膚線維芽細胞の編集困難な4標的では、平均1.88倍を記録した。線維芽細胞に24塩基対のFLAGタグと18塩基対の6×Hisタグを挿入する実験も含まれていた。
研究チームはさらに、475組のpegRNA–標的コンストラクトをHEK293T細胞のゲノムに組み込んだ評価プラットフォームTRAP-seq-PEを構築した。標的DNAをディープシーケンシングし、意図した編集の割合を測定することで、複数の置換・挿入・欠失の効率を比較する。このライブラリーでは、enRERVベースのエディターは既存ツールに比べ、全体平均で約1.8倍、編集困難な標的群で約2.74倍の効率を示した。これらの値は、4つの内在性標的での平均1.88倍とは区別する必要がある。
意義と展望：ツールの選択肢を広げ、用途ごとの検証へ
複数遺伝子の同時編集は、先行変異体RERV-m5を用いたイネ実験で確認された。再生イネ60個体のうち28個体で3遺伝子が同時に編集され、割合は46.7%だった。最終版enRERVを使った再生イネの実験では、別途、2つの内在性標的で編集活性が確認された。
キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）に関連する4遺伝子に終止コドンを導入する実験も行われた。ただし、CAR-T細胞の抗がん効果や持続性の向上を直接検証したわけではない。安全性評価の範囲にも限界がある。予測オフターゲット部位12か所で変異が検出されなかった結果は、RERV-m5で編集したイネに限られる。植物・動物細胞での編集事象17件では、enRERVとM-MLVベースのシステムの間に、編集副産物の大きな差は認められなかった。
ライブラリーと内在性標的で効率向上幅が異なった理由として、著者らは送達・発現方法やクロマチン環境の違いを挙げた。これは可能性のある説明であり、直接実証された機序ではない。治療や育種に応用するには、目的の細胞と標的で効率、副産物、安全性をさらに評価する必要がある。研究はAdvanced Scienceに掲載され、実験設計と結果は論文全文で確認できる。
CRISPR-based prime editors (PEs) install precise edits into genomic DNA without generating double-strand breaks. Their editing efficiency is highly dependent on reverse transcriptases (RTs), but efficient RT candidates remain limited. Here, we identified 19 novel active RTs by screening 558 candidates. Among them, RERV-RT, derived from Rattus norvegicus, exhibited the highest activity. Through structure-guided engineering and deep mutational scanning, we developed an optimized variant, enRERV-RT, which outperforms conventional M-MLV-RT-based PE systems by 1.20-fold in mammalian and plant cells, and by 1.88-fold at hard-to-edit loci, while enabling precise multiplex editing of functionally relevant genes. Additionally, we developed a high-throughput platform, TRAP-seq-PE, to systematically evaluate prime editor performance. Across diverse mutation types, we found that PE systems based on enRERV-RT exhibited higher editing efficiencies than those based on M-MLV-RT. Collectively, our work establishes a versatile, high-efficiency PE system, thereby facilitating advances in clinical gene therapy and precise crop breeding.
特定の標的でプライムエディティング効率が低い研究チームにとって、逆転写酵素を切り替えて比較する選択肢が増えた。目的配列の挿入がうまくいかない場合、同じ細胞・標的・送達条件でM-MLVベースとenRERVベースのツールを比較し、意図した編集と副産物を併せて測定する実験を設計できる。TRAP-seq-PEは複数の編集タイプの性能比較に使えるが、その後に実際の内在性標的での検証が必要だ。育種研究では、再生イネの編集結果を出発点に、目的形質と後代への遺伝を確認できる。治療分野では候補ツールが得られたという意義はあるものの、患者での有効性、臨床上の安全性、承認までの期間短縮を証明した成果と解釈する段階ではない。