プライム編集ガイドRNAの内部相補性を抑え、設計最適化の負担を軽減するSPELL
背景：ガイドRNA内部の結合が編集効率を左右する
プライム編集ガイドRNA（pegRNA）の内部相補性を低減すると、編集効率を高められる。この考え方を用いたSPELLは、事前のPBS最適化を行わなくても、複数の標的で既存設計に近い効率を示した。Nucleic Acids Researchに掲載された本研究では、文献データの解析とヒト由来細胞での実験により、ガイドRNAの設計条件を評価した。
プライム編集は、ガイドRNAに記された情報に基づいてDNA配列を書き換える技術である。プライマー結合部位（PBS）は、ニックが入ったDNA鎖の3′末端と結合し、逆転写の開始を助ける。一方、PBSが同じpegRNAのスペーサー領域と相補的に結合すると、編集を妨げることがある。そのためPBSの長さを決める際は、DNAとの結合だけでなく、RNA内部の相互作用も考慮する必要がある。
研究チームは、約3,000種類のpegRNAと末端保護型pegRNA（epegRNA）に関する既存データを解析した。末端保護により最適なPBS長が短くなるという先行観察とは異なり、今回の解析では平均編集効率が最も高くなるPBS長に、両タイプ間で明確な差は認められなかった。特定の標的で得られた長さの基準を一般化するのは難しいことを示す結果だ。
主な発見：ミスマッチ設計による効率向上とSPELLによる設計の簡素化
研究チームは、PBSとスペーサーの相互作用を弱めるよう設計した300種類以上の改変pegRNAを試験した。HEK293T細胞を用いたプラスミドベースの蛍光レポーター系では、特定のスペーサー単一塩基ミスマッチによって、編集効率が対応するミスマッチなしの対照群の最大7.2倍になった。効果は最適でないPBS長でより顕著だったが、すべてのミスマッチが有利だったわけではない。PBSと相補的なスペーサー領域のうち、PAMから離れた位置に単一ミスマッチを導入した46種類の設計では、24種類で効率が有意に上昇し、1種類では低下した。PAMはCas9が標的を認識するために必要な隣接配列である。
SPELLは、個々の組み合わせを広範に最適化する負担を抑えるための手法だ。17–20ヌクレオチド長のPBSに単一塩基欠失を導入し、主要なゲノム標的での比較では20ヌクレオチドPBSの13番目の塩基を削除した。これはガイドRNAの設計変更であり、標的DNAに導入しようとする欠失とは異なる。
HEK293T細胞で解析した25種類のpegRNAの全体比較では、SPELLと短いPBSを用いた設計の編集活性に有意差は認められなかった。ただし、統計的な同等性が証明されたわけではない。比較に含まれた7つの設計群のうち3群では、既存設計より効率が有意に低かった。ヒト胚性幹細胞株HuES9では、GBA1標的の効率が文献に基づく設計の1.5倍だった一方、LRRK2標的では有意差がなかった。
意義と展望：初期設計候補として活用できるが、標的ごとの検証は必要
SPELLの主な成果は、長いPBSに単一塩基欠失を加える比較的簡単な設計で、複数の標的において既存のPBS設計に近い性能が得られたことだ。スペーサーのミスマッチも組み合わせると、一部の標的では最適なPBSを上回る効率が得られたが、最良の組み合わせを見つけるには広範な最適化が必要だった。したがって、特定のミスマッチ実験で得られた最大7.2倍の向上を、SPELL全般に当てはまる効果と解釈すべきではない。
作用機序も完全には解明されていない。内部相補性による抑制が、常にCas9の切断活性低下として現れるわけではなく、研究チームは逆転写開始など後続段階への影響の可能性を挙げた。試験した条件では、意図しない挿入・欠失の増加や、一部の既知オフターゲット部位での編集増加を示す兆候はなかった。しかし、包括的な安全性や患者における治療効果を証明した研究ではない。タンパク質–RNA複合体（RNP）送達での性能も、体系的な追加評価が必要である。
研究設計と結果は、提供された論文全文で確認できる。
プライマー結合部位（PBS）の長さと配列は、Prime Editing の効率にとって重要であり、PBS と Prime Editing ガイド RNA（pegRNA）スぺーサーとの分子内相補性が大きな課題となっています。我々は文献解析と、PBS‑スぺーサー相互作用を弱めた 300 種以上の改変 pegRNA を用いた実験により、これらの要因の影響を調査しました。エンド保護のないプラスミド導入 pegRNA においては、エキソヌクレアーゼによる PBS 端部の分解により、効率的なプライミングに必要な長さよりも実質的に長い PBS が必要とされると示唆されていますが、3,000 以上の pegRNA に関する文献データを解析した結果、epegRNA と従来の pegRNA の最適 PBS 長さに有意な差は見られませんでした。また、スぺーサーまたは PBS 配列にミスマッチを導入して相補性を破壊すると、編集効率が最大で 7 倍向上することが確認されましたが、この効果は非最適な PBS 長さで顕著でした。スぺーサーのミスマッチと PBS の欠失を組み合わせると、最適 PBS と比較してもさらに編集効率が向上しましたが、最適な組み合わせを見つけるには広範な最適化が必要です。本研究では、SPELL（Streamlined Prime Editing with fixed-Length PBS Leverage）を用いることで、事前の pegRNA 最適化を行わずに、17〜20 塩基長の PBS に 1 塩基の欠失を組み込んだ設計により、ほとんどのケースでほぼ最適な編集効率を達成しました。
細胞ベースの遺伝子機能研究で新しい標的のpegRNAを設計する際、SPELLを既存のPBS設計と並行して試す初期候補として検討できる。複数のPBS長を幅広く検討する前に、単一塩基欠失を加えた長いPBS設計で十分な編集効率が得られるかを確かめる方法だ。ただし、一部の標的では性能が低かったため、編集効率と意図しない挿入・欠失を標的ごとに比較する必要がある。送達方法や細胞種が異なる場合も、性能を改めて確認すべきだ。今回の結果は設計探索の負担を減らせる可能性を支持するが、実際の時間・費用の削減幅、治療薬開発期間の短縮、臨床安全性を実証したものではない。