背景

イネの既存のゲノム編集ツールを最適化し、タンパク質検出用タグを正確に挿入できた個体の割合を、特定の標的で3倍に高めた研究がaBIOTECHに掲載された。鍵となったのは、Tf1逆転写酵素変異体の導入とコドン最適化である。意図しない編集も観察されており、編集精度全般が向上したと解釈することはできない。

研究チームが以前に開発したヌクレアーゼ介在型プライム編集（NM-PE）は、SpCas9ヌクレアーゼと、マイクロホモロジー介在末端結合（MMEJ）に基づくプライム編集を組み合わせたシステムだ。植物の内在性遺伝子にタンパク質を識別する標識配列を挿入できるが、比較的長い3 × FLAGタグの挿入効率の改善が課題として残っていた。今回の研究では、既存システムの構成要素を変更して性能を高めることを目指した。

主な発見

研究チームは、従来のモロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）由来逆転写酵素を、哺乳類PE6システムで使われたTf1系変異体evoTf1M4に置き換えた。続いて、同じタンパク質をコードしながらコドンの使い方が異なる構成体を比較した。コドン最適化とは、タンパク質のアミノ酸配列を保ったまま、それをコードする塩基配列を調整する方法である。実験にはイネ品種Kitaakeを用い、アグロバクテリウムで編集構成体を導入した独立した一次形質転換体（T0）を解析した。

最初に作製したrPE20aでは、試験した3つの遺伝子座のいずれでも正確なタグ挿入は検出されなかった。一方、トウモロコシのコドン使用に合わせて最適化したrPE20aV3は、イネの実験で最も高い挿入効率を示した。Tf1変異体への置換だけで性能向上が保証されるわけではなかった。ただし、こうした差を説明する分子的な原因が立証されたわけではない。

66塩基対（bp）の3 × FLAG配列を挿入する実験では、rPE20aV3によりOsCPK6標的のT0個体48個体中9個体で正確な挿入が得られた。割合は18.75%で、従来のrPE14bの48個体中3個体（6.25%）の3倍に当たる。この割合は、全DNA分子に占める編集済み分子の割合ではなく、正確な挿入が確認された形質転換個体の割合である。別の標的であるOsCPK3とOsCPK4では、それぞれ48個体中7個体（14.6%）、48個体中5個体（10.4%）だった。挿入は塩基配列解析で確認され、免疫ブロットではタグ付きタンパク質の予想分子量に合致するシグナルが検出された。

点変異の導入には別の構成体rPE20cを用いた。OsACCaseでは、比較構成体rPE14aでは検出されなかった正確な編集が、rPE20cを使った45個体中5個体（11.1%）で確認された。一方、OsGS3ではrPE14a、rPE20cのどちらも48個体中7個体（14.6%）で同じだった。性能向上の程度は標的によって異なった。

意義と今後の展望

今回の成果は、イネの内在性タンパク質に検出用タグを付ける機能ゲノミクス研究ツールの改善と位置づけられる。正確な挿入が得られる個体の割合が上がれば、後続解析に用いる研究用系統を確保しやすくなる可能性がある。

限界も明確だ。タグ挿入を試験した3つの遺伝子座すべてで、小さな挿入・欠失や不完全なタグ挿入など、意図しない編集が観察された。タグ付きタンパク質の検出は確認されたが、元のタンパク質の機能が保たれたことを示す証拠とは区別する必要がある。他品種や他作物での再現性、後代での安定性、収量や耐ストレス性の改善も、今回の結果だけでは判断できない。実際に利用するには、標的ごとの最適化と編集系統の個別検証が必要になる。

研究結果と実験条件は原著論文（aBIOTECH）に記載されている。