背景

ゲノムの特定部位に長いDNAを正確に挿入する技術は、遺伝子治療および機能ゲノミクスの核心的なツールである。従来のCRISPR–Cas9ベースの相同性修復（HDR）は、標的DNAの二重鎖切断（DSB）を前提としている。この過程では、大きな欠失・挿入変異、染色体再配置、p53媒介のDNA損傷反応が生じる可能性がある。分裂が遅い細胞ではHDR効率も低い。

プライム編集はCas9ニッカーゼと逆転写酵素を結合し、DSBなしで塩基を修正するが、長い配列を挿入するには制約があった。ツインプライム編集や再結合酵素・転移酵素結合方式は挿入容量を増やしたが、編集を複数のステップに分けるか、別途の酵素と認識配列を必要とした。異なる変異を同時に解析する飽和変異解析でも、変異ごとに複雑なガイド設計が必要だった。復旦大学の研究チームはこうした限界を縮小するために、寄与体補完的プライム編集（donor-complementary prime editing, DoPE）を開発した。Nature Biotechnology論文

核心的発見

DoPEは、両端に短い3′単鎖突出部を持つ二重鎖DNA寄与体（odsDNA）、突出部と補完的なプライム編集ガイドRNA二本（opegRNA）、核移動信号を強化したPE2編集機で構成される。PE2が標的ゲノムの両側に寄与体末端とペアになる3′フラップを作ると、約30ヌクレオチド長の補完配列が寄与体を標的部位に結合させる。再結合酵素や転移酵素は使用しない。

研究チームはHEK293T細胞のACTB-EGFPレポーターで108塩基対の区間を置換し、蛍光タンパク質変異を生成し、H9ヒト胚性幹細胞およびHeLa細胞でも挿入を確認した。合成単鎖オリゴヌクレオチドプールと同一のopegRNA一対を組み合わせることで、EGFP標的領域のアミノ酸単位およびヌクレオチド単位の飽和変異解析も可能になった。変異ごとに新たなガイドRNAを作成せず、寄与体ライブラリだけを変更できる点が従来のプライム編集スクリーニングと異なる。

挿入規模は数十塩基対から1.4kb、2.1kb、3.1kbを経て最大12.5kbまで拡張された。1.4kb CMV-EGFPカセットはHEK293T細胞のAAVS1およびTP53領域、H9細胞のAAVS1領域で検証され、12.5kbの挿入もAAVS1およびTP53標的で確認された。odsDNAは部分補完的な合成単鎖DNAを結合するか、末端を保護したPCR産物をラムダエキソヌクレアーゼで処理して作製可能だった。

意義と展望

疾患モデルでは、常染色体優性型多嚢胞肝疾患に関連するPRKCSHの変異エクソンを正常配列に丸ごと置換した。研究チームは異なる変異を持つHEK293T細胞およびH9細胞でエクソンを個別または同時置換し、編集後のPRKCSHタンパク質発現の回復を観察した。変異塩基ごとに修正ツールを別途設計する代わりに、変異を含むエクソン全体を正常版に置き換える「変異非依存的」戦略である。

ただし今回の成果は培養細胞実験にとどまる。長いodsDNAと大型PE2*を組織に一緒に送達する問題、細胞タイプやゲノム位置による効率差、不完全挿入および寄与体の非標的統合の有無を広範に評価する必要がある。オフターゲット解析もコンピュータで予測した候補部位中心であり、全ゲノムレベルの安全性検証を代替することはできない。研究チームがDoPEに関する特許を準備中であるという利益相反も、技術比較と再現性評価で考慮すべき点である。