背景

作物の形質は、単一ヌクレオチドの変異だけでなく、調節領域やタンパク質ドメインを含む、数十から数百ヌクレオチドに及ぶ配列の違いによっても影響を受ける。優れた品種のゲノム領域全体を所望のアレルで置き換えるには、大規模な相同性置換が必要となるが、植物において、効率と精度を両立させることは困難であった。

従来のCRISPR-Cas9ベースの相同性再結合には、DNA二本鎖の切断と外部テンプレートの供給が含まれる。しかし、植物細胞は非相同性末端接合を優先する傾向があり、挿入/欠失の副産物が生成され、組織培養および植物再生中に編集効率が著しく低下する。プライムエディティング（PE）は、Cas9ニッカーゼ、逆転写酵素、およびプライムエディットガイドRNA（pegRNA）を利用して、二本鎖切断なしに目的の情報を標的部位に導入する。しかし、従来のPEは通常、短い置換および挿入/欠失に限定され、100塩基対を超える配列の置換には大きな制約がある。

主な発見

研究者らは、大規模なDNA挿入に使用される戦略であるテンプレートジャンププライムエディティング（TJ-PE）を拡張し、イネにおける相同性置換に応用した。TJ-PEは、逆転写酵素が編集テンプレートを連続的に読み取り、新たに合成されたDNAを標的遺伝子座の反対端に接続できるように設計されている。これにより、単一のpegRNAの逆転写酵素テンプレート内に長い配列全体を収容する必要がある従来のPEの構造的負担が軽減される。

研究者らは、イネゲノムにおいて、数十から数百塩基対のDNA断片を、同じ長さの相同性配列と置き換えた。最も長く置き換えられた領域は340塩基対であった。重要な発見は、ヌクレオチドを単純に追加するのではなく、元のゲノム断片を削除し、同じ長さの設計された配列と置き換えることに成功したことである。これは、天然アレルに存在する複数の変異または領域内の連続した機能モチーフを、領域ごとに移動させる可能性を示している。

TJ-PEの応用は、置換に限定されない。研究者らは、定義された位置で944〜2,024塩基対のゲノム断片を正確に削除した。約2,000塩基対が削除された場合でも、最も高い効率は34.6%であった。その結果、同じ編集システムを使用して、大規模な断片の正確な置換とキロベース規模の欠失の両方を実行することが可能になった。

意義と展望

この結果は、イネにおけるPEの編集範囲を、単一のヌクレオチドまたは短い配列から、遺伝子機能領域のレベルへと拡大するものである。病害抵抗性、環境ストレスへの適応、収量、品質に関連するアレルは、しばしば互いに近接して存在する複数の変異を含む。TJ-PEを確実に適用できる場合、これらの有用な配列クラスターを一度に再現することが可能になり、個々の変異を個別に編集する必要がなくなる。また、長い調節配列を削除して遺伝子発現を変化させたり、特定のタンパク質ドメインをコードする領域を置き換えたりすることも可能である。

ただし、示された最大効率がすべての標的および品種で再現されるとは限らないと考えるのは難しい。性能は、ガイドRNA構造、標的フランキング配列、クロマチンへのアクセス性によって異なり、正確な置換と部分的な編集およびオフターゲット副産物の比率を徹底的に検証する必要がある。編集された形質の世代間の安定性、農業形質の安定性、およびゲノム全体レベルでのオフターゲット変異の評価も、商業育種前に確認する必要がある重要な課題である。

この技術を、小麦やトウモロコシなどのゲノムサイズまたは倍数性が大きい作物に拡張できるかどうかは、今後の研究で明らかになるだろう。これは、今後の研究の重要な焦点となるだろう。