背景

ゲノムを改変せずに特定の転写産物のみを減少させるRNA標的型CRISPRは、遺伝子機能研究やRNA医薬品開発において高い応用性を持つ。単一タンパク質として働くPspCas13bやRfxCas13d（CasRx）、複数サブユニットからなるCsmなどが代表的である。これらのシステムのRNAノックダウン効率は、通常逆転写定量PCR（RT–qPCR）で評価される。

問題は、切断部位を横断する増幅産物（amplicon）を設計する慣例にある。切断後に残ったRNA断片が増幅されることを防ぐためだが、実際の転写産物減少と測定過程の干渉を区別できない可能性は十分に検討されていなかった。米ジョンズ・ホプキンス大の研究チームは、触媒活性を失ったCsmでも強いノックダウンを示す矛盾から出発し、定量法そのものを検証した。

核心的発見

研究チームはHEK293T細胞において、核内XISTと細胞質BRCA1を標的とし、野生型Csmとリボヌクレアーゼ欠損型Csm3-D33Aを比較した。切断能力を持たない変異体でもRT–qPCRでは野生型と同等のノックダウンを示したが、タンパク質解析やmCherryフローセル分析では減少が確認されなかった。RNAが単に結合しただけではなく、測定値が歪んでいることを意味する。

誤差はプライマーポジションによって大きく異なる。BRCA1でガイドRNA結合部位を横断する増幅産物ではリボヌクレアーゼ欠損型のノックダウンが78%、近接上流の増幅産物では42%と計算されたが、下流では減少が見られなかった。野生型でも横断増幅産物では92%と測定されたが、下流では64%であった。XISTの場合、横断位置では野生型と欠損型ともに約90%であったが、下流測定値はそれぞれ35%と14%にとどまった。同様の現象はPspCas13bとCasRxでも再現された。

原因はRNA抽出過程で一緒に精製されたガイドRNAにある。このRNAが標的転写産物に再結合し、逆転写酵素の進行を妨げ、結合部位に近い上流領域のcDNA合成を低下させた。合成ガイドRNAを逆転写反応に加えると濃度依存的に誤差が発生し、プロテアーゼK処理では回復しなかった。上流妨害効果は距離が遠くなるほど減少し、約500ヌクレオチド外では消失し、適切な曲線の減衰定数は170ヌクレオチドであった。

意義と展望

研究チームは、ガイドRNAに相補的な3′デジキシシチジン末端抗センスオリゴヌクレオチド（ddASO）でガイドを隔離し、測定値を回復させた。強いストランド交換能と長連続合成能を持つ逆転写酵素ultraMarathonRT（uMRT）を用いた場合、欠損型CsmとPspCas13bの偽ノックダウンが消失し、野生型の位置依存測定値も互いに近づいた。

研究室では、uMRTのような進行性・ストランド交換型逆転写酵素と標的部位を横断するプライマーや、既存酵素を維持する場合はガイド結合部位の下流で定量する必要がある。タンパク質発現、フローセル分析、RNAシーケンシングなどの独立分析も並行して行うべきである。ただしRNAシーケンシングもRNA断片化前にcDNAを合成すれば影響を受ける可能性がある。

今回の結果は、既存のRNA標的CRISPR論文の効率数値がすべて間違っているという意味ではない。誤差の大きさはガイドRNA量と結合力、抽出法、逆転写プライミング方式に左右される。フェノール・クロロホルム抽出は小さなRNAを濃縮し問題を悪化させる可能性があり、オリゴ(dT)プライミングでは結合部位上流全体が影響を受ける可能性がある。siRNA、shRNA、ASO研究でも同様の位置依存誤差を再検討する理由が生じた。