背景：送達体の選択とオフターゲット変異の評価

マウスの筋肉では、脂質ナノ粒子（LNP）で送達したCRISPR-Cas9は、アデノ随伴ウイルス（AAV）による送達よりも標的部位への挿入割合が低かった。一方、ヒト細胞では、特定のガイドRNA（gRNA）に関連する高頻度のオフターゲット変異が観察された。研究チームは、計算による予測、DNA切断実験、細胞内の変異解析を組み合わせ、こうしたリスクを評価する枠組みを示した。

研究対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のジストロフィン遺伝子のエクソン45である。2種類のgRNAでエクソンスキッピングを誘導し、タンパク質の読み枠を回復させる戦略で、LNPにはCas9メッセンジャーRNA（mRNA）と2種類のgRNAを封入した。DNAを送達しない方法には、ベクターDNA断片が挿入されるリスクの低減が期待される。ただし、Cas9が標的以外の部位を切断するリスクは別途評価する必要がある。

主な発見：マウスでの挿入解析とヒト細胞での11候補

マウス実験には、各群4匹のレポーターモデルを用いた。左の腓腹筋に投与し、28日後に右の腓腹筋へ同じ用量を投与した後、2回目の投与から28日後に両側の組織を解析する設計だった。挿入・欠失（indel）を含むリードの割合は、LNPの1回目と2回目の投与でそれぞれ3.60%、3.55%、AAVではそれぞれ10.29%、0.68%だった。反対側の筋肉に反復投与した条件での結果であり、同じ筋肉への再投与や患者での治療効果にまで拡大して解釈することはできない。

挿入を含むリードの割合は、LNPでは各投与とも0.51%、AAVの初回投与では5.69%だった。由来を追跡した10塩基対を超える挿入のうち、LNPで観察されたものの半数超は、レポーターに含まれるヒトDMDエクソン45配列と一致した。Cas9 mRNA・gRNA由来の配列はほとんど検出されない水準だったと報告されており、外来配列が完全に存在しないことまで証明した結果ではない。

オフターゲット解析では、13種類の予測ツールを比較した。その後、配列に基づくCas-OFFinderの予測、試験管内でDNA切断部位を特定するCIRCLE-seq、正常核型を持つヒト人工多能性幹細胞（iPSC）2系統の全ゲノムシーケンシング（WGS）を統合する手法を採用した。2系統はいずれも同じ健常者に由来し、検出感度を高めるため高用量のLNPで処理した。異なるindelパターンが3つ以上重なる領域を「indelクラスター」と定義し、培養中に自然発生した変異と、編集に関連する候補変異を区別しようとする方法である。

統合解析でオフターゲット候補を11か所特定し、そのうち10か所はgRNA #23に関連していた。標的アンプリコンシーケンシングでは、9番染色体の候補部位の1つでindel頻度が58–85%に達した。これは高用量のLNPで処理したiPSCの特定部位で測定した、挿入と欠失を合わせた頻度である。挿入単独の頻度でも、患者における有害事象の発生率でもない。

意義と展望：前臨床安全性評価には相互検証が必要

予測ツールは感度と適合率を同時に高めることができなかった。計算上の候補、試験管内の切断、細胞内で生じた変異を区別して相互検証する必要がある理由だ。オフターゲット変異のパターンは、iPSCとヒト筋系細胞の間でも異なり、条件間での検出再現性も限られていた。

平均約60–80倍の深度のWGSでも、低頻度変異をすべて捉えることはできない。反復配列では、配列アラインメントのエラーが候補判定に影響する可能性も残る。LNPとAAVの比較では、投与量をモル数ベースで厳密にそろえられていないため、送達体間の差を一般化する際には注意が必要だ。

本研究は、送達体の選択とgRNAごとのリスク評価を併せて設計する根拠となる。患者での有効性と長期安全性、規制承認要件を満たすかどうかは、今後の検証課題である。研究デザインと結果はMolecular Therapy Nucleic Acidsの論文に掲載された。