背景

DNAが巻きつくヒストンH3のリジン残基は、メチル化やアセチル化などの翻訳後修飾を受けて、遺伝子発現や染色質構造を調節する。特定の修飾の機能は、それを付加または除去する酵素を阻害して推論されてきた。しかし、一つの酵素が複数のタンパク質を修飾したり、非触媒的機能まで行ったりし、また異なる酵素が同じ部位を補完する可能性があるため、観察された表現型を特定のヒストンマーカーの効果として断定するのが難しかった。

ヒストン残基を直接置き換えれば、このような混同を減らすことができるが、哺乳類では実現が困難である。マウスの標準型H3.1とH3.2はそれぞれ9個と3個の遺伝子が複数の染色体クラスターに散在しており、非標準型H3.3もH3f3aとH3f3bの2つの遺伝子によって作られている。従来の塩基修正は編集範囲が狭く、意図しない周辺塩基まで変化する可能性があるため、複数のH3コピーを精密に操作するには限界があった。Nature Genetics原著論文の研究チームは、この問題をCRISPRプライム編集で解決した。

核心的発見

研究チームは、Cas9ニッカーゼと逆転写酵素を結合したPEmax、不一致修復を一時的に抑制するMLH1dn、強化型プライム編集ガイドRNA（epegRNA）を組み合わせた。PE2・PE3b・PE4・PE5bを比較した結果、MLH1dnを含むPE4とPE5bが最も高い編集効率と最も低い挿入・欠失頻度を示した。その後、ドキシサイクリンでPEmaxとMLH1dn発現をオンにするマウス胚性幹細胞株を作製し、長期的な不一致修復抑制の負担も軽減した。

H3K23をアルギニンに置き換える試験では、単一細胞クローンの35％が80％を超える編集率を示した。2つのクローンはH3.1の18個の対立遺伝子だけでなくH3.2も完全に置き換えられ、H3K23アセチル化シグナルもほぼ消失した。変異を再びリジンに戻す逆編集や、H3K14・K18・K23の3か所を同時に変える組み合わせ編集も可能だった。ただし、三重編集効率は単一残基編集より約4～5倍低かった。

研究チームは、リジンをアルギニンに置き換えた細胞とアミノ酸を維持する同義対照群を比較し、H3K4、K9、K14、K18、K79が胚性幹細胞適合度に重要であることを確認した。H3K14とK18の同義編集はそれぞれ70～100％、75～90％に達したが、該当のアルギニン変異では高編集細胞が選択的に消失した。H3K4Rも繰り返し形質導入13回後、36個のクローンのうち2個のみが11～12％編集にとどまった。

標準型H3のK18を変えると、H3.3がプロモーターとインハンサーに多く組み込まれてアセチル化損失を補償した。H3.3も置き換えると、この再分布が消失した。H3K56R細胞はDNA損傷薬エトポシドにより敏感であり、H3K27RとH3K36RまたはH3K37Rを併せ持つ細胞は単一変異より集落形成と自己更新能力が低下した。

意義と展望

今回の研究は、ヒストン修飾酵素ではなく、修飾が起こる残基自体を元のゲノム位置で精密に試験できるプラットフォームを提示した。標準型と非標準型H3間の補償作用、異なるリジン間の機能的相互作用まで分離して分析できる点が強みである。がんで見つかるヒストン変異が細胞成長や転写、DNA修復をどのように変えるかも、同じ枠組みで検証できる。

安全性問題は残る。複数の遺伝子座位を同時に狙ったクローンでヒストンクラスターの複製数減少が条件別に4～34％観測され、25キロベイス挿失や染色体13ヒストンクラスターの一側のメガベイス規模の消失も確認された。ニッキングRNAを除いてもすべての座位でリスクが減るわけではない。研究結果も培養マウス胚性幹細胞に限定される。ヒト細胞や分化組織、生体内モデルへの拡張には、長距離ゲノム解析と独立クローン検証を基本手順とすべきである。