10キロベース以上の遺伝情報を一度に正確に挿入、遺伝子治療効率を最大化するDoPE技術が公開
背景
遺伝子編集分野において、二重鎖切断（Double-Strand Breaks, DSBs）を誘導することなく広範囲のDNA配列を正確に挿入する技術は、遺伝子治療の長年の課題であった。従来のCRISPR-Cas9技術は、DNAの二重鎖を切断し、細胞自体の修復機構に依存するため、意図しない突然変異が発生するリスクを伴う。これを克服するために開発されたプライム編集（Prime Editing）技術はDSBsを誘導しないため安全であるが、一度に挿入できるDNAサイズが数十塩基対レベルと狭いという限界があった。
大容量のDNA断片をゲノムに挿入するために、再結合酵素（Recombinase）や転座酵素（Transposase）を組み合わせる方法も試された。しかし、これらの方法は多段階の編集を経るため効率が低下し、不要な痕跡配列を残すため臨床応用が難しいという問題があった。大容量の遺伝情報を安全かつ精密に、一度の反応でゲノムに挿入する新たなアプローチが急務だった。
核心的発見
研究チームは、これらの限界を乗り越えるため、ドナー補完的プライム編集（Donor-Complementary Prime Editing, DoPE）技術を開発した。このシステムは、挿入対象の遺伝情報を含む3'-オーバーハング二重鎖DNA（3'-overhang Double-Stranded DNA, odsDNA）ドナー、このドナーの末端オーバーハング配列と結合する一対のオーバーハング補完的プライム編集ガイドRNA（Overhang-Complementary Prime Editing Guide RNAs, opegRNAs）、およびPE2プライムエディター（PE2 Prime Editor, PE2*）を組み合わせた構成である。
DoPEは、約30個のヌクレオチドレベルの短いオーバーハングを持つodsDNAドナーを活用することで効率を高めた。研究チームは、小さな断片から最大12.5キロベース（kb）に達する遺伝物質までを正確に挿入できることを実験で証明した。追加の再結合酵素なしに一度の反応で大容量の遺伝情報をゲノムに挿入した形となる。
研究チームは、DoPEの性能を検証するために、強化型緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）遺伝子の標的領域を対象にインシトゥ（in situ）飽和突然変異誘発（Saturation Mutagenesis）実験を行った。opegRNAsの一対と合成された単鎖オリゴヌクレオチドで構築したドナー・プールを使用し、アミノ酸とヌクレオチドレベルの精密な突然変異ライブラリーを構築した。
さらに、DoPE技術を活用したPRKCSH遺伝子突然変異修復試験も行われた。遺伝子の故障したエクソン（Exon）部分を交換する実験において、研究チームはさまざまな突然変異を持つ対立遺伝子を同時にまたは個別に正常配列に変換した。これは、突然変異の種類に関係なく正常遺伝子を挿入する突然変異無関（Mutation-Agnostic）治療の基盤を築いた成果と評価されている。
意義と展望
DoPE技術は、既存のプライム編集の大容量遺伝子挿入の限界とゲノム切断に伴うリスクを同時に克服した。個々の突然変異ごとにカスタム設計するガイドRNAの煩雑さから解放され、損傷していない巨大な遺伝子ブロックをまるごと挿入する汎用的な遺伝子治療法が可能になると予測される。再結合酵素などの外部因子を排除したため、臨床応用時の生体安全性面でも大きな利点を持つ。
ただし、この技術が臨床現場に応用されるにはまだ解決すべき課題がある。細胞試験で証明された高い編集効率が生きている動物体内でも均一に現れるかを検証する必要がある。巨大なサイズの遺伝物質とタンパク質複合体を疾患標的部位まで安全に届ける体内送達技術との融合も解決課題である。大容量遺伝物質導入過程で予期しない標的外効果（Off-target effect）が発生するかを精密に追跡する長期研究も続く必要がある。
二重鎖切断（DSBs）を回避する正確なゲノムDNA挿入法は、限られたスループットや多段階編集の必要性により制約されていた。本研究では、3'-オーバーハング二重鎖DNA（odsDNA）ドナー、一対のオーバーハング補完的プライム編集ガイドRNA（opegRNAs）、およびPE2*プライムエディターを組み合わせたドナー補完的プライム編集（DoPE）を報告し、最大12.5キロベース（kb）のDNA配列を正確に挿入することを実現した。一つのopegRNAペアと合成された単鎖オリゴヌクレオチドから構成されたドナー・プールを用いて、標的EGFP領域におけるインシトゥ（in situ）飽和突然変異をアミノ酸およびヌクレオチドレベルで示した。短い（約30ヌクレオチド）オーバーハングを用いたDoPEは、小断片から10kbを超える挿入までをサポートする。さらに、PRKCSHの突然変異エクソンを個別または同時に入れ替えることで、多様な突然変異を修正し、in vitroで一貫した突然変異無関（Mutation-Agnostic）アプローチを確立した。本研究は、再結合酵素や転座酵素を必要とせず、一度の反応で大容量DNA断片を正確に挿入するDSBフリーでライブラリー対応の方法としてDoPEを示した。
DoPE技術の実質的な価値は、希少遺伝病治療薬の開発方法を根本的に変える点にある。例えば、患者ごとに遺伝子変異の位置が異なる血友病や遺伝性眼科疾患の場合、従来は患者の特有の点突然変異部位を一つひとつ標的とする治療薬を設計しなければならなかった。一方、DoPEを活用すれば、突然変異が頻繁に起こるエクソン全体や遺伝子全体を一度に正常配列に交換できるため、同一の治療プラットフォームで複数の患者を治療する汎用治療薬の設計が容易になる。
また、ゲノムスクリーニング分析研究における活用価値も高い。約30個の塩基対の短いオーバーハングを持つドナー・ライブラリーを設計し、突然変異プールを生成することで、特定のタンパク質の構造的変化が薬物結合力や疾患誘発に与える影響を高解像度で迅速にスクリーニングする大規模新薬候補物質開発プラットフォームの構築に有用と期待される。