細胞外小胞で送達した遺伝子編集ツール、脊髄小脳失調症モデルでATXN3を抑制
背景
脊髄小脳失調症3型（SCA3）は、ATXN3遺伝子のCAGリピートが伸長し、毒性を持つアタキシン3タンパク質が生じる常染色体顕性遺伝の神経変性疾患である。研究チームは遺伝子編集ツールを細胞外小胞（EV）に搭載し、患者由来細胞と2種類のマウスモデルに送達して、ATXN3発現の低下と標的部位の編集を確認した。
CRISPR-Cas9で原因遺伝子を不活化するには、編集ツールを標的細胞内へ届ける必要がある。編集酵素が長期間残存する可能性も考慮しなければならない。そこで本研究では、Cas9タンパク質とシングルガイドRNA（sgRNA）からなるリボ核タンパク質（RNP）複合体を一時的に送達する方法に焦点を当てた。
主な発見
研究チームは、脂肪酸の付加を促すパルミトイル化シグナルと、光切断可能なリンカータンパク質PhoClをSpCas9に結合させ、EVに搭載した。分離したEVに送達前に410 nmの光を照射すると、Cas9がパッケージングシグナルから切り離される設計だ。光は分離済みのEVに照射し、Cas9はEVの内部でパッケージングシグナルから分離する。
編集標的はATXN3のエクソン2だった。CAGリピートを正常な長さに戻すのではなく、遺伝子機能を不活化する方法であり、正常アレルと変異アレルを区別しない。細胞への取り込みを高めるため、ウイルスエンベロープ糖タンパク質VSV-Gを表面に発現させたEVを用いた。患者由来の人工多能性幹細胞（iPSC）を処理して72時間後、変異型ATXN3タンパク質はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）対照群に比べ平均28.58%、正常型は21.21%減少した。
2種類のマウスモデルでも結果が得られたが、評価指標は異なる。変異型ATXN3と発光レポーターを発現させた線条体モデルでは、EVを脳内に直接注入し、2週間後に正規化発光量を測定した。sgRNAを含まずCas9のみを搭載したEVを注入した対照半球と比べ、平均34.42%低かった。ヒトATXN3遺伝子を持つYAC SCA3 84.2モデルでは、EVと緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するレンチウイルスベクターを小脳に同時注入した。4週間後、選別したGFP陽性細胞で標的部位の編集が最大15.6%確認された。この数値は小脳全体の編集率ではない。
意義と展望
今回の結果は、EVが編集ツールを一時的に運び、ATXN3を部分的に不活化できることを示した前臨床の概念実証である。運動症状の改善や患者への治療効果を確認した結果とは解釈できない。正常型タンパク質も減少しており、脳への直接注入後にEVが限られた範囲にしか分布しないことも課題として残る。
一時的な送達であることは、安全性が証明されたことを意味しない。SpCas9・sgRNAプラスミドを細胞に導入した初期のオフターゲット評価では、予測した4部位のうち1部位で、挿入・欠失の水準が対照のバックグラウンドを約2.4%上回った。研究者らは、より包括的な評価が必要だと明記している。この評価は、EVを投与した動物の安全性を総合的に調べた試験とは区別する必要がある。
研究の設計と結果は、Biomaterials掲載の原著論文で確認できる。
スピノセレベラーアタキシア3型（SCA3）は、ATXN3遺伝子のCAGトラクトの過剰増加によって引き起こされる神経変性性優性遺伝疾患であり、ataxin-3タンパク質に毒性をもたらします。CRISPR-Cas9酵素を用いたゲノム編集は、変異型ATXN3アレルを不活性化するための有望な戦略ですが、in vivoでの輸送は依然として課題です。細胞外ベシクル（EV）は、Cas9とシングルガイドRNA（sgRNA）リボ核タンパク質を最小限に抑えてゲノムへの露出を抑える、有望な輸送ベクターです。この研究では、SpCas9にパルミトイル化モチーフを設計し、SpCas9とsgRNAをEVに濃縮できるようにしました。光切断性リンカー - PhoCl - を導入することで、EV内のパルミトイル化モチーフからSpCas9を光誘起的に解放し、in vitroでのATXN3への標的結合を高めることができました。SpCas9リボ核タンパク質を搭載したEVは、SCA3患者由来のiPSCと2つのSCA3動物モデルでATXN3ノックアウトに成功しました。これらの発見は、一時的な遺伝子編集ツールの輸送のための革新的なルートを強調しています。このアプローチは、SCA3を含む遺伝性疾患の治療のための有望な治療プラットフォームを提供します。
脳疾患の遺伝子編集では、何を切断するかだけでなく、編集ツールをどこへ、どれくらいの時間届けるかが鍵となる。本研究は、Cas9タンパク質・RNA複合体をEVに搭載し、投与前に光を使ってパッケージングシグナルから切り離す製造・送達法を示した。今後の研究では、このプラットフォームを用いて脳内分布や投与経路を比較し、正常型ATXN3の減少による影響とオフターゲットを評価できる。ただし、編集ツールの滞留が一時的でも、DNA編集の結果は持続する可能性がある。より侵襲性の低い投与法で十分な数の標的細胞に届くか、分子レベルの変化が症状改善につながるかを確かめる必要があり、それが治療戦略としての価値を判断する条件となる。