東アジアで多い難聴関連GJB2 c.235delC変異、細胞モデルでプライム編集による修復率58％を達成
背景
遺伝性難聴にはさまざまな遺伝的要因があり、GJB2遺伝子の変異は代表的な原因の一つに挙げられる。特に東アジアでは、GJB2 c.235delCが頻度の高い病原性変異として報告されている。本研究では、この変異を含む細胞モデルでプライム編集を最適化し、58.05％の修復効率を達成した。
補聴器や人工内耳は聴こえを補助するが、遺伝子の異常そのものを修復するものではない。そこで、変異配列を直接修正する遺伝子編集法が研究されている。ただし、細胞で配列を修復できたことと、実際に聴力を回復させる治療効果とは区別する必要がある。
プライム編集（prime editing、PE）は、精密な遺伝子改変のための技術である。本研究では、ガイドRNA、編集酵素、ニッキング戦略を組み合わせ、この変異の修復効率を高めた。
主な発見
研究チームは、c.235delC変異を含む疾患細胞モデル293T-GJB2mut-EGFPを開発し、正常な遺伝子配列の復元を目指して遺伝子編集の最適化実験を行った。
まず、プライム編集ガイドRNA（prime editing guide RNA、pegRNA）の構造を調整した。プライマー結合部位（primer binding site、PBS）を9塩基対、逆転写鋳型（reverse transcription template、RTT）を16塩基対とする組み合わせでは、PE2システムで修復効率37.15％を記録した。pegRNAの3′末端にCsy4またはevopreQ1モチーフを付加した場合も、効率は約37％でほぼ同じだった。
2つの同義変異を導入するpegRNAMMD2戦略により、修復効率は48.94％に上昇した。7種類のプライム編集酵素変異体のうち、PEmaxが最も高い活性を示し、49.14％に達した。「+1 nick sgRNA」を用いるPE3bニッキング戦略を適用すると、修復効率は58.05％となった。この数値は細胞モデルでの実験結果であり、患者の聴力回復率を示すものではない。
アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、AAV）の搭載容量の制限に対応するため、2つのAAVを用いる分割システムも構築した。研究チームは、PEmaxタンパク質を1153番目と1154番目のアミノ酸残基の間で分割するスプリットインテイン設計を採用した。ニッキングを最適化した後の修復効率は、従来の分割位置である1024番目と1025番目の残基の間を用いるシステムと、統計的に有意な差がなかった。ただし、有意差が認められなかったことだけで、両設計の同等性が証明されたとはいえない。
意義と展望
本研究は、東アジアで多いGJB2 c.235delC変異の修復に向けた編集の組み合わせと、分割送達設計を提示した。修復効率58.05％は今後の研究の出発点となるが、患者の治療に十分な有効性が得られたことを示す根拠ではない。
オフターゲット編集の解析では、予測上位4か所をディープシーケンシングで調べた結果、背景レベルを上回る統計的に有意な編集の増加は確認されなかった。検査した部位に限られた結果であり、オフターゲット編集がまったくないことや、全般的な遺伝毒性リスクが低いことを断定することはできない。
本研究は体外の細胞モデルで実施された。同じ修復活性が実際の内耳で得られるか、また生体内送達が聴力回復につながるかは、別途検証する必要がある。提供された抄録には、動物や患者での有効性、長期安全性の結果は示されていない。研究チームは今回の成果を、今後のAAVを用いた生体内遺伝子治療研究の基礎と位置づけている。
出典：Gene Therapy掲載論文の抄録・書誌情報
Hereditary hearing loss, predominantly attributed to mutations in the GJB2 gene, constitutes a significant global health issue, with the c.235delC mutation being the most prevalent pathogenic allele in East Asian populations. Existing interventions, such as hearing aids and cochlear implants, mitigate symptoms but fail to correct the underlying genetic defects, highlighting the need for precise therapeutic approaches. In this study, we developed a cellular disease model (293T-GJB2mut-EGFP) incorporating the c.235delC mutation and employed prime editing (PE) to restore the GJB2 functionality. We systematically optimized the pegRNA architecture and identified that the optimal pegRNA (PBS 9 bp, RTT 16 bp) achieved 37.15% correction with PE2. Incorporating Csy4 or evopreQ1motifs at the pegRNA 3' end resulted in comparable efficiencies (~37%). The introduction of two synonymous mutations (pegRNAMMD2) increased the efficiency to 48.94%. Among the seven prime editor variants, PEmax showed the highest intrinsic activity (49.14%). The PE3b nicking strategy with a + 1 nick sgRNA further improved the efficiency to 58.05%. To address adeno-associated virus (AAV) packaging limitations, a split-intein dual-AAV system for PEmax (bisected between residues 1153-1154) was developed. After nicking optimization, it showed comparable correction efficiency to a previously reported split site (residues 1024-1025), with no statistically significant difference. Off-target deep sequencing of the top four predicted loci revealed no significant editing above the background. These findings establish a comprehensively optimized prime editing toolkit for GJB2 c.235delC correction and provide a foundation for future AAV-mediated in vivo gene therapy for hereditary hearing loss.
本研究の実質的な価値は、GJB2 c.235delCの修復に向けた具体的な編集設計の候補を示した点にある。今後この変異の修復を検証する研究者は、pegRNAの設計、PEmaxとPE3bの組み合わせ、分割AAVシステムを評価候補にできる。ガイドRNA末端にモチーフを付加しても効率がほぼ同じだったという結果も、設計選択の参考になる。ただし、細胞モデルで得られた修復率が実際の内耳でも再現されるかは未確認である。今後の生体内研究では、送達効率、標的細胞の編集、聴力の変化、安全性を分けて評価する必要がある。現時点の結果から、特定の内耳注入法の効果、補聴器や人工内耳を置き換えられる可能性、治療薬開発期間の短縮を予測することはできない。