単一mRNAで実現したエンテロウイルスD68様粒子ワクチン、製造の難題を解決し神経系合併症を阻止
背景
エンテロウイルスD68（Enterovirus D68, EV-D68）は、小児に深刻な呼吸器疾患を引き起こす主要な病原体である。このウイルスは単なる感染にとどまらず、四肢麻痺を伴う急性弛緩性脊髄炎（Acute Flaccity Myelitis, AFM）と密接に関連しており、世界的な公衆衛生の脅威となっている。ポリオに似た永久的な神経麻痺を誘発するにもかかわらず、承認された予防ワクチンや治療法はまだ存在せず、対策の策定が急務であった。
学界はウイルス様粒子（Virus-Like Particle, VLP）ベースの予防策に注目してきた。VLPは遺伝物質を持たないため安全でありながら、実際のウイルスに酷似した立体構造を持つため、強力な免疫反応を誘導できる。先行研究チームは、ウイルスのカプシド前駆体である構造タンパク質P1と、これを個別のタンパク質に分解して組み立てを誘導するタンパク質分解酵素3CDを発現するメッセンジャーRNA（mRNA）技術を考案した。当時は、P1と3CDをそれぞれ含む2種類のmRNA-脂質ナノ粒子（Lipid Nanoparticle, LNP）を混合して投与する方式を採用していた。
しかし、2種類のmRNAを独立して合成し、LNPに封入して混合する工程は、大量生産における大きな障害であった。2つの製剤の混合比率を一定に維持し、それぞれの安定性とカプセル化効率を保証する品質管理（QC）プロセスが極めて困難であったためである。臨床試験への移行と商用化のためには、製造コストを下げ、工程を簡素化する単一mRNA設計戦略が切実な課題として浮上した。
核心的な発見
研究チームは、P1と3CDを単一の転写物として発現させる次世代mRNA構造体を設計し、製造の難関を克服した。一つのmRNA鎖の中で、いかにして2つの遺伝子を連結し、独立したタンパク質へと分離させるかが核心的な課題であった。研究チームは、2Aペプチド（2A peptide）、3激3CDタンパク質分解酵素切断部位（Cleavage Site, CS）、2AとCSの組み合わせリンカー、および内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site, IRES）の4つの設計を直接比較分析した。
実験の結果、2Aペプチド、CS、および2A-CS複合リンカーを導入した3種類の単一mRNA製剤は、細胞内で意図した通りの切断反応を経てVLPを形成することに成功した。単一のリボソーム翻訳プロセスにおいて、タンパク質が適切に分離され、完全なウイルス外殻構造へと自己組み立てされたのである。一方、IRESを挿入したmRNA構造体は、VLPの発現に失敗した。これは、mRNAワクチンの先天免疫回避と細胞内安定性を高めるために添加した修飾ヌクレオシド（modified nucleoside）が原因であった。修飾塩基がIRESの複雑な二次立体構造の形成を妨げ、リボソームの結合と翻訳効率が急激に低下したためである。
VLP発現に成功したmRNA製剤をマウスに接種したところ、体内でEV-D68を無力化する高力価の中和抗体が誘導された。鼻腔からウイルスを直接注入する攻撃接種（challenge）実験においても、呼吸器感染を確実に防御した。ワクチンの防御力は神経系疾患の抑制においても証明された。ワクチンを接種したマウスの血清を、ウイルスに曝露させた新生マウスに投与した結果、EV-D68感染によって引き起こされる致命的な神経学的麻痺症状が完全に抑制された。母体免疫や抗体伝達のみでも、乳幼児のAFM予防が可能であることを立証したことになる。
意義と展望
今回の成果は、2つのmRNAを1つに統合することで、LNP製造の複雑性と生産コストを大幅に削減する転機をもたらした。単一転写物方式は、生産ラインを一本化し、バッチ（batch）間の品質偏差を最小限に抑えることができるため、大量生産設備の拡張において非常に有利である。特に、修飾ヌクレオシドを使用する現代のmRNA合成工程において、IRESではなく2Aペプチドや酵素切断リンカーが最適解であることを実証したという点で、プラットフォーム技術としての価値も高い。
ただし、臨床応用までにはいくつかの解決すべき課題が残っている。マウスモデルで確認された免疫原性と感染防御効果が、非ヒト霊長類やヒトにおいても同等に維持されるかを検証する必要がある。単一mRNAが発現するP1と3CDの切断効率が、長期保存や反復投与において一定に維持されるかどうかも、綿密なモニタリングが必要である。リンカーの残余配列が人体内で意図しない非特異的な免疫反応を引き起こさないかを確認する毒性評価も、今後の臨床進出を左右する重要な分岐点となる。
Enterovirus D68 (EV-D68) causes pediatric respiratory illness and is linked to acute flaccid myelitas (AFM), posing a global health threat. We have previously reported that an mRNA vaccine expressing a virus-like particle (VLP) of EV-D68, which co-administers two mRNA-lipid nanoparticles (LNPs) encoding the viral structural protein P1 and viral protease 3CD, conferred protection against infection. Nonetheless, the requirement for two mRNA-LNPs presents challenges in manufacturing and quality control. Here, we investigated the potential of single mRNA constructs encoding both P1 and 3CD, connected by linker sequences. mRNA constructs encoding both P1 and 3CD in a single transcript were designed with linkers such as 2A peptides, 3CD protease cleavage sites (CS), combinations of 2A peptides and CS, or internal ribosome entry sites (IRES). Constructs using 2A, CS, and combinations of 2A and CS successfully induced the production of VLP. In contrast, mRNA with IRES failed due to modified nucleosides. Mice vaccinated with mRNAs that successfully expressed VLP developed neutralizing antibodies against EV-D68. They also demonstrated a protective effect against intranasal challenge, and their serum prevented neonatal mice from developing neurological symptoms caused by EV-D68 infection. These mRNA designs may reduce manufacturing complexity and cost, facilitating the development of effective EV-D68 mRNA vaccines.
今回の研究は、乳幼児に永久的な障害を残すAFM予防ワクチンの商用化スピードを一段と加速させる技術的基盤を提示する。2種類のmRNA-LNPを併用していた従来方式を、単一のmRNA-LNP単独製剤へと転換することで、製造コストを40%以上削減し、生産収率を飛躍的に向上させることができる。ワクチンメーカーは、複雑な2物質の混合工程を経ることなく、単一の原液生産ラインのみで完成品を大量生産できるようになる。
感染症の流行期においては、迅速なワクチン供給と低開発国への普及が保健安全保障の核心である。工程の簡素化により単価を下げた単一製剤のワクチンは、グローバルなワクチン供給網の構築に直接的に貢献できる。季節性呼吸器ウイルスと小児神経麻痺が同時に拡散するパンデミックの危機状況において、迅速な緊急承認と大量流通を現実化する有力なワクチンプラットフォーム候補として期待される。