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PCR & Quantitative Amplification

Protocolos de PCR y amplificación cuantitativa

Mantén separados PCR convencional, qPCR, RT-PCR, RT-qPCR y dPCR/ddPCR desde el diseño del ensayo hasta la reacción, el ciclado, los controles y la revisión del resultado.

Protocolo inicial editable

10 protocolos iniciales ligados a la fuente

¿Qué hace este protocolo?

Introduce la secuencia objetivo, el kit y el instrumento que realmente utilizarás. No infieras condiciones universales ni conviertas la revisión MIQE o dMIQE en una garantía de éxito experimental.

Alcance compatible

  • • Conventional PCR
  • • qPCR / Real-time PCR
  • • RT-PCR
  • • RT-qPCR
  • • dPCR / ddPCR

Límites de aplicación

Las condiciones permanecen ligadas a la fuente y a la revisión verificadas. No se mezclan valores entre kits, instrumentos, rutas o perfiles distintos ni se declara un éxito experimental universal.

SP-PCR-001Conventional PCR

PCR de punto final rutinaria basada en Taq — protocolo inicial de 25 µL

PCR & Quantitative Amplification · CURATED-SP-PCR-001-V1

Guía oficial revisada
ORDERED_STEPSTARGET_SPECIFIC_OLIGOS_REQUIREDMANUFACTURER_IFU_OVERRIDESCONTROL_GATED

Completa primero los datos de tu ensayo

Introduce tus secuencias y condiciones reales. No se inventan valores que la fuente no indique.

1

DEFINIR OBJETIVO Y CEBADORES

Registre acceso o región genómica, tamaño esperado del amplicón y un par de cebadores específicos validados. Este inicio no proporciona secuencias.

Condition: REQUERIDO POR EL USUARIO: introduzca ambas secuencias y verifique especificidad, orientación y temperaturas de fusión.
2

CREAR MAPA DE TUBOS Y CONTROLES

Asigne muestras y controles antes de abrir reactivos para interpretar cada resultado frente a contaminación y amplificación.

Condition: Incluya NTC y control positivo; añada blanco de extracción cuando corresponda.
3

PREPARAR LA MEZCLA MAESTRA

Prepare mezcla con cebadores para todas las reacciones más exceso de pipeteo. Añada la plantilla por separado.

Temperature: En hielo o según la mezcla seleccionadaReagent: 12,5 µL de mezcla Taq 2×; 0,5 µL de cada cebador 10 µM; agua; plantilla aparteCondition: 25 µL finales; mezcla 1×; 0,2 µM de cada cebador; prepare 10 % de exceso.
4

ALICUOTAR Y AÑADIR PLANTILLA

Dispense la mezcla, añada el volumen previsto a cada muestra, sustituya plantilla por agua sin nucleasas en el NTC, cierre y centrifugue brevemente.

Condition: Use puntas resistentes a aerosoles y mantenga material post-PCR fuera del área de preparación.
5

DESNATURACIÓN INICIAL

Desnaturalice la plantilla usando la condición inicial de una reacción Taq rutinaria.

Duration: 30 segundosTemperature: 94–95 °CCondition: Use una desnaturalización más larga solo si la plantilla o IFU lo exige.
6

CICLO: DESNATURACIÓN

Desnaturalice el ADN amplificado al inicio de cada ciclo.

Duration: 15–30 segundosTemperature: 94–95 °CCondition: 25–35 ciclos totales; elija ciclos según abundancia y validación.
7

CICLO: ALINEAMIENTO

Alinee el par de cebadores validado. Optimice con gradiente si el ensayo es nuevo o la especificidad es baja.

Duration: 15–60 segundosTemperature: Comience aproximadamente 5 °C por debajo del Tm menorCondition: No fije temperatura antes de conocer Tm y especificidad.
8

CICLO: EXTENSIÓN

Extienda el amplicón con la temperatura y velocidad requeridas por la polimerasa seleccionada.

Duration: Aproximadamente 1 minuto por kbTemperature: 68–72 °CCondition: Siga la IFU de la enzima si difiere de este punto de partida Taq.
9

EXTENSIÓN FINAL Y ESPERA

Complete productos parcialmente extendidos y mantenga las reacciones hasta recogerlas.

Duration: 5 minutos; después mantenerTemperature: 68–72 °C; después 4–10 °C
10

VERIFICAR EL PRODUCTO FINAL

Resuelva una alícuota con marcador de tamaño y confirme el producto esperado. Interprete muestras solo si los controles se comportan como previsto.

Condition: No acepte la corrida si el NTC contiene producto del tamaño objetivo o falla el control positivo.