## 배경 RNA 치료제 시장이 급속도로 팽창하면서 완제품의 순도와 서열 정확성을 검증하는 품질 관리의 난이도 역시 높아졌다. 소형 간섭 RNA(Small Interfering RNA, siRNA)나 크리스퍼 유전자 가위(CRISPR/Cas9)에 쓰이는 단일 가이드 RNA(Single Guide RNA, sgRNA) 등은 화학적 변형이 빈번하게 발생한다. 분자 수준에서 나타나는 미세한 변형이나 극미량의 불순물은 치료 효능을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 예기치 못한 면역 반응을 촉진할 수 있어 정밀한 분석이 요구된다. 기존 바이오 업계에서는 액체크로마토그래피-질량분석(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS) 장비로 RNA 서열을 검증해 왔다. 그러나 기존 LC-MS/MS 분석은 이미 설계된 표적 서열과 대조하여 일치 여부만 확인하는 방식에 그쳤다. 샘플 내부 정보를 사전 지식 없이 처음부터 끝까지 해독하는 신독점적(de novo) 서열 규명이 불가능했기 때문이다. 이로 인해 분석 과정에서 기존 설계와 미세하게 다른 유사 불순물이나 예상치 못한 위치의 염기 변형을 잡아내지 못하고 그대로 흘려보내는 한계가 상존했다. ## 핵심 발견 최근 학계에서는 이러한 분석 한계를 극복하기 위해 새로운 형태의 시퀀싱 플랫폼이 제시됐다. 연구진이 개발한 3차원 차세대 질량분석 시퀀싱(Three-Dimensional Next-Generation Mass Spectrometry-based Sequencing, 3D NGMS-Seq) 기술은 복잡한 혼합 RNA 샘플을 분석하여 서열을 사실상 100%에 달하는 정확도로 직접 읽어낸다. 연구진은 기존의 질량 값과 머무름 시간(Retention Time, tR)이라는 2차원 데이터 구조에 '질량분석 신호 강도(MS intensity)'를 세 번째 변수로 결합했다. 화학적으로 제어된 산 가수분해(controlled acid hydrolysis)를 거친 RNA 샘플은 다양한 길이의 래더(ladder) 단편 조각으로 쪼개져 질량-강도-tR의 3차원 레이어로 분산된다. 복잡하게 뒤섞인 데이터 속에서 연구진은 모체 RNA의 풍도와 잘려 나간 단편들의 신호 강도를 정렬하는 중첩 알고리즘(nested algorithm)을 적용해 개별 RNA 성분을 전산적으로 분리해 냈다. 각 레이어별로 분리된 단편들은 인접한 조각 간의 정밀한 질량 차이를 토대로 염기가 하나씩 호출(base-calling)된다. 표준 뉴클레오타이드는 물론이고 화학적으로 변형된 메틸화 염기까지 순차적으로 규명된 뒤, 최종적으로 전체 길이의 RNA 서열로 재조립되는 방식이다. 이 기술은 합성 siRNA, 마이크로 RNA(Micro RNA, miRNA), sgRNA 등을 대상으로 수행한 검증 실험에서 뛰어난 성능을 보였다. 특히 기존 분석법으로는 식별이 거의 불가능했던 미세한 메틸화 이성질체인 Um과 mU, Am과 mA의 위치적 모호성을 명확히 해결해 냈다. 더불어 혼합물 내 개별 RNA의 상대적인 양과 특정 위치의 변형 비율을 수치 데이터로 정량화하는 성과를 거두었다. ## 의미와 전망 이번 연구는 설계 서열 정보를 미리 입력하지 않고도 미지의 RNA 혼합물을 정밀하게 분석할 수 있는 기반을 다졌다는 점에서 의미가 깊다. 신약 개발사들은 이 기술을 활용해 초기 후보물질 도출 단계에서부터 미량의 구조적 이성질체와 불순물을 투명하게 모니터링할 수 있다. 이는 복잡한 올리고뉴클레오타이드 제제의 화학적 조성을 완벽히 통제해야 하는 규제 기관의 엄격한 승인 기준을 충족하는 데 큰 도움을 줄 전망이다. 다만 임상 및 상업적 제조 현장에 전면 도입되기 위해서는 몇 가지 기술적 보완이 요구된다. 대규모 생산 공정에서 대량의 샘플을 실시간으로 분석하기에는 현재의 3차원 전산 분리 알고리즘 연산 속도와 분석 처리량이 병목 구간으로 작용할 가능성이 크기 때문이다. 복잡한 화학적 변형이 고밀도로 축적된 긴 사슬 RNA 분자를 분석할 때 해독 정확도를 유지할 수 있도록 시퀀싱 알고리즘을 고도화하는 과제도 남았다.